莫湘濤，張依山，李勇軍

（河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院 1髖部疾病研究治療中心，2風濕科，3檢驗科，河南鄭州450046）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）臨床上一般表現(xiàn)為對稱性手足小關節(jié)或多關節(jié)侵襲性炎癥、晨僵、腫痛等，是以炎性滑膜為主的慢性系統(tǒng)性疾病，若治療不及時或不當，常危及關節(jié)外器官，嚴重者甚至可導致關節(jié)畸形，致使關節(jié)功能障礙［1-2］。因此早期治療RA 以控制疾病進展對改善患者生活質(zhì)量意義重大。硼替佐米（bortezomib，BTZ）作為蛋白酶體抑制劑（protease inhibitor，PI），治療多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤非常有效，還可用于治療自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和RA 等［3-5］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）能夠與靶基因3'端非翻譯區(qū)互補結(jié)合，降解靶基因或抑制其編碼蛋白，參與機體多種自身免疫或炎癥性疾病，比如miR-223在RA患者外周血單個核細胞（peripheral blood mono?nuclear cells，PBMC）中異常表達，與RA 活動程度相關，有望成為診斷RA 的生物標志物［6-7］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體介導的免疫反應在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，可激活procaspase-1，經(jīng)剪切轉(zhuǎn)化后形成具有生物活性的caspase-1，進而促進炎癥因子釋放［8］。還有研究顯示，miR-223能夠下調(diào)NLRP3水平，NLRP3為 miR-223 的靶基因［9］。然而 BTZ 能否通過調(diào)控miR-223 和NLRP3 參與人單核細胞促炎反應還未見相關報道，因此本研究從RA 患者外周血分離單核細胞，以不同濃度脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）進行體外誘導，再經(jīng)BTZ 處理后，測定相關指標，以探究BTZ的作用機制。

材料和方法

1 試劑和儀器

BTZ（≥98%，貨號：B125789）和 LPS（貨號：L118716）購自上海阿拉丁試劑有限公司；DMEM 培養(yǎng)液（貨號：90013）和胎牛血清（貨號：F8250）均購自北京索萊寶科技有限公司；miR-223 及內(nèi)參照U6的引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：EH0201）、IL-1β ELISA 試劑盒（貨號：EH0185）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（貨號：EH0302）及兔抗人cas?pase-1抗體（貨號：FNab01284）均購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔抗人NLRP3 抗體（貨號：K004108P）、兔抗人細胞因子信號抑制物1（suppres?sor of cytokine signaling 1，SOCS1）抗體（貨號：K005441P）和兔抗人含SH2 結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酶1（SH2 domain-containing inositol phosphatase-1，SHIP-1）抗體（貨號：bs-3567R-1）均購自上海恒斐生物科技有限公司。Varioskan LUX 多功能酶標儀和Ap?plied Biosystems ProFlex PCR 擴增儀均購自Thermo Fisher Scientific；K8300 全自動凝膠成像系統(tǒng)購自南京世研儀器設備有限公司。

2 方法

2.1 RA 患者外周血的采集和單核細胞分離培養(yǎng)外周血標本均取自本院10 例RA 患者，且半年內(nèi)均未使用免疫調(diào)節(jié)性藥物。所有患者及家屬均對本研究知情，并簽訂臨床研究協(xié)議書，本研究經(jīng)本院倫理學委員會批準，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。收集RA 患者外周抗凝血，加入淋巴細胞分離液，使用密度梯度離心法分離出PBMC，按照試劑使用說明書，使用MidiMACS 免疫磁性吸附柱分離裝置對PBMC 進一步分離，人CD14+磁珠分選單核細胞，流式細胞術(shù)檢測CD14+單核細胞得率＞95%可用于后續(xù)實驗，并在光學顯微鏡下觀察形態(tài)。將分離出的單核細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、相對濕度98%的培養(yǎng)箱中，隔天換液，胰酶消化傳代。

2.2 LPS 誘導單核細胞 收集培養(yǎng)的單核細胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1.0×108/L，接種至24孔板中，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，隨后加入1 mL含有 LPS（終濃度為 10 mg/L）［10］的 DMEM 培養(yǎng)液，設置6 個復孔，分別誘導6、12、24 和48 h，誘導結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測定上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，以確定最佳誘導時間。

2.3 BTZ 處理LPS 誘導后的單核細胞 選取經(jīng)LPS在最佳誘導時間處理后的單核細胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1.0×108/L，接種至24 孔板中，隨后加入1 mL含有BTZ（終濃度分別為5、10、25、50和100 nmol/L）［11］的 DMEM 培養(yǎng)液，設置 6 個復孔，常規(guī)培養(yǎng) 24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測定上清液中 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，以確定BTZ 最佳處理濃度。后續(xù)實驗分組為：（1）對照組（未經(jīng)LPS 誘導）；（2）LPS 誘導組（單核細胞經(jīng)LPS 誘導24 h）；（3）BTZ 組（50 nmol/L BTZ處理LPS誘導后的單核細胞）。

2.4 ELISA 法測定單核細胞上清液中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平 收集處理后或未經(jīng)處理的單核細胞上清液，采用 ELISA 法檢測上清液中 IL-6、IL-1β 和TNF-α水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

2.5 RT-qPCR 法測定單核細胞中miR-223 水平使用TRIzol 法提取各組單核細胞中總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄得cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：1μL RT Enzyme Mix Ⅰ，1μL Random 6-mers，4μL 5× PrimeScript Buffer，2 μL Oligo（dT）Primer，10μL RNase-free ddH2O，2 μL 總RNA。以 cDNA 為模板進行qPCR 擴增。miR-223 上游引物序列為5'-CAGAAAGCCCAATTCCATCT-3'，下游引物序列為5'-GGGCAAATGGATACCATACC-3'；內(nèi)參照 U6 上游引物序列為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。反應體系（20 μL）：0.8 μL fluorescent probe so?lution，1.0μL DNA 模板，上、下游引物各2μL，0.4μL ROX Reference Dye（50×），10.0 μL Premix Ex TaqTM，3.8 μL ddH2O。擴增條件：94℃ 2 min；94℃30 s，58℃ 60 s，68℃ 2 min，40 個循環(huán)；68℃ 8 min。確認擴增曲線和熔解曲線，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算miR-223相對表達水平，每個樣本重復6次。

2.6 Western blot 法測定單核細胞中 NLRP3、cas?pase-1、SOCS1 和 SHIP-1 蛋白水平 用 RIPA 蛋白裂解液充分裂解各組單核細胞，離心取上清液，用BCA法測定蛋白含量，以50 mg 樣品進行上樣，行SDSPAGE，電轉(zhuǎn)膜，室溫下50 g/L 牛血清白蛋白封閉結(jié)合位點 2 h，加入 I 抗（NLRP3、caspase-1、SOCS1、SHIP-1 和β-actin 抗體），4℃下孵育過夜，加入羊抗兔IgG/HRP，25℃避光孵育1 h，曝光、顯色后觀察。使用凝膠成像軟件Image Lab分析灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組比較行單因素方差分析，任意兩組相比行SNK-q檢驗。P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 單核細胞形態(tài)觀察

未經(jīng)LPS 誘導的單核細胞呈類球形，分布均勻，形態(tài)規(guī)整；經(jīng)LPS 誘導24 h 后，細胞多呈梭形、聚集狀，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of monocytes without LPS induc?tion and after LPS induction for 24 h.Scale bar=50μm.圖1 未經(jīng)LPS誘導與LPS誘導24 h后的單核細胞形態(tài)圖

2 LPS 誘導不同時間對單核細胞炎癥因子分泌水平的影響

與未經(jīng)LPS誘導（0 h）相比，LPS誘導6、12、24和48 h后，單核細胞上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），且呈時間依賴性，誘導24 和48 h后IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此后續(xù)實驗采用LPS 誘導24 h 后的單核細胞，見圖2。

Figure 2.Effect of LPS induction for different time on the levels of inflammatory factors secreted by monocytes.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 0 h；*P＜0.05 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h.圖2 LPS誘導不同時間對單核細胞炎癥因子分泌水平的影響

3 不同濃度BTZ 對LPS 誘導后單核細胞炎癥因子分泌水平的影響

與未經(jīng) BTZ 處理相比，經(jīng) 5、10、25、50 和 100 nmol/L BTZ 處理后，單核細胞上清液 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，50和 100 nmol/L BTZ 處理后 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此后續(xù)實驗采用50 nmol/L BTZ處理LPS誘導后的單核細胞，見圖3。

Figure 3.Effects of different concentrations of BTZ on secretion of inflammatory factors by monocytes after LPS induc?tion.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 nmol/L；#P＜0.05 vs 5 nmol/L；△P＜0.05 vs 10 nmol/L；▲P＜0.05 vs 25 nmol/L.圖3 不同濃度BTZ 對LPS 誘導后單核細胞炎癥因子分泌水平的影響

4 各組單核細胞中miR-223 水平和NLRP3 蛋白水平的比較

與對照組相比，LPS誘導組miR-223水平顯著降低，NLRP3 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05）；與LPS誘導組相比，BTZ 組miR-223 水平顯著升高，NLRP3蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Comparison of miR-223 level（A）and NLRP3 protein level（B）in monocytes of each group.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS induc?tion group.圖4 各組單核細胞中miR-223 水平和NLRP3 蛋白水平的比較

5 各組單核細胞中 caspase-1、SOCS1 和 SHIP-1 蛋白水平的比較

與對照組相比，LPS 誘導組 SOCS1 和 SHIP-1 蛋白水平顯著降低，caspase-1 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05）；與LPS誘導組相比，BTZ組SOCS1和SHIP-1 蛋白水平顯著升高，caspase-1 蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），見圖5。

Figure 5.Comparison of caspase-1，SOCS1 and SHIP-1 protein levels in monocytes of each group.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS induction group.圖5 各組單核細胞中caspase-1、SOCS1 和SHIP-1 蛋白水平的比較

討 論

RA 發(fā)病機制和病因尚不明確，學術(shù)界認為其發(fā)生、發(fā)展進程與炎癥反應相關，大量研究資料表明，成纖維細胞、巨噬細胞、T 細胞和單核細胞可在外來因素刺激下，釋放大量炎癥因子，參與RA 進程［12-13］。LPS 是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，RA 患者外周血單核細胞對LPS 刺激反應性增高。本研究用不同濃度LPS 誘導，24 h 后的單核細胞多呈梭形、聚集狀，提示經(jīng)LPS 誘導后，細胞形態(tài)發(fā)生一定改變；檢測相關炎癥因子水平顯示，與未經(jīng)LPS誘導相比，LPS誘導6、12、24 和 48 h 后，單核細胞上清液 IL-6、IL-1β 和 TNF-α水平升高，提示LPS 誘導后，單核細胞炎癥因子分泌增加。研究報道，BTZ可用于治療RA合并多發(fā)性骨髓瘤，且無副作用［4］。本研究顯示，與 LPS 誘導組相比，BTZ 組單核細胞IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平降低，提示BTZ可以抑制人單核細胞中炎癥因子的分泌。

近幾年，miR-223 在機體炎癥反應中的異常表達受到廣大學者們的關注，研究顯示，miR-223 在輻射性肺損傷組織中高表達，而NLRP3 低表達，miR-223 可能通過下調(diào)NLRP3 水平從而抑制IL-1β、IL-18和 caspase-1 表達，以減輕炎癥反應［14］。屈紅林等［15］研究顯示有氧運動可上調(diào)慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）抑郁小鼠海馬組織中miR-223 水平，下調(diào)NLRP3 水平，從而緩解CUMS 抑郁小鼠海馬組織炎癥反應。進一步探究顯示，miR-223能夠靶向調(diào)控NLRP3水平，參與炎癥性腸病進程［16］。本研究顯示，與對照組相比，LPS 誘導組 miR-223 水平降低，NLRP3 水平升高，而與 LPS 誘導組相比，BTZ 組 miR-223 水平顯著升高，NLRP3 水平顯著降低，說明BTZ 可上調(diào)miR-223 水平，抑制NLRP3 表達，可能通過此機制拮抗LPS 刺激后單核細胞的促炎反應。SOCS1 和SHIP-1 是LPS 誘導炎癥反應的負調(diào)控蛋白，其水平越低提示炎癥反應越嚴重［17］。caspase-1 是 NLRP3 炎癥通路的下游蛋白，NLRP3 可激活caspase-1，進而誘導細胞分泌IL-1β、TNF-α 等炎癥因子［18］。本研究顯示，與對照組相比，LPS 誘導組 SOCS1 和 SHIP-1 水平降低，caspase-1 水平 升高 ，而 與 LPS 誘 導組 相 比 ，BTZ 組 SOCS1 和SHIP-1 水平升高，caspase-1 水平降低，提示 BTZ 可能通過上調(diào) SOCS1 和 SHIP-1 水平，下調(diào) caspase-1 水平，從而抑制LPS誘導的單核細胞促炎反應。

綜上所述，BTZ 可能通過阻斷miR-223/NLRP3軸活性，下調(diào) IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平，減少 LPS 誘導的人單核細胞炎癥因子分泌。但本研究僅進行體外觀察，后期還應進行動物實驗分析BTZ 相應機制，以進一步驗證本研究結(jié)論。