田 雯，陳 瓏，馬艷華，吳開李，符國宏

1.三亞中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 三亞 572000；

2.三亞中心醫(yī)院普外科，海南 三亞 572000

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，早期大多數(shù)患者的臨床癥狀不明顯，不容易被發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時，已到進(jìn)展期胃癌，導(dǎo)致其預(yù)后較差，病死率較高［1］。因此，尋找一種能早期篩查胃癌的生物學(xué)標(biāo)志物對改善胃癌患者的預(yù)后具有很大的幫助。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性、非編碼的小分子RNA，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮重要的作用，可能參與胃腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道腫瘤存在miR-135及miR-601的異常表達(dá)，對胃腸道腫瘤的診斷及預(yù)后判斷具有重要的幫助［3-4］。糖類抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）及糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）是胃腸道腫瘤常用的血清腫瘤標(biāo)志物，對胃腸道腫瘤的診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后評估具有一定的作用［5-6］。然而，關(guān)于血清miR-135及miR-60水平對早期胃癌診斷的研究鮮有報道。本研究通過檢測不同胃疾病中的血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平，探討其對早期胃癌的診斷價值，以期為胃癌的診療提供指導(dǎo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2016年1月1日—2019年9月30日三亞中心醫(yī)院收治的胃癌患者152例，其中男性104例，女性48例，年齡31～78歲，中位年齡58.50歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌的診斷依據(jù)胃鏡檢查及組織病理學(xué)檢查結(jié)果；② 在接受治療前進(jìn)行各指標(biāo)檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腫瘤復(fù)發(fā)，無法配合本研究；② 合并其他惡性腫瘤，血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及嚴(yán)重肝腎疾病。另選取同期因胃部疾病于三亞中心醫(yī)院就診的96例非胃癌患者（萎縮性胃炎25例、非萎縮性胃炎38例、胃潰瘍33例），其中男性64例，女性32例，年齡28～75歲，中位年齡57歲；同期選擇對照組60例健康體檢者（男性38例，女性22例），年齡35～76歲，中位年齡60.40歲。本研究通過三亞中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后，與患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 分組方法

根據(jù)胃癌患者病情進(jìn)展程度，分為早期胃癌組（62例）和進(jìn)展期胃癌組（90例）。腫瘤局限于胃黏膜的黏膜層和黏膜下層，未突破基底膜為早期胃癌；癌組織浸潤到黏膜下層，進(jìn)入肌層或已穿過肌層達(dá)漿膜為進(jìn)展期胃癌。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）腫瘤的TMN分期分為：Ⅰ期28例，Ⅱ期37例，Ⅲ期63例，Ⅳ期24例。根據(jù)胃癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組79例和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組73例。

1.2.2 miR-135及miR-601檢測

采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測各組血清miR-135及miR-601表達(dá)水平。miR-135基因上游引物為5’-ATGTACGCTACTGTGAGCTG-3’，下游引物為5’-GTCAGCGAGTGAGCATAG-3’；miR-601上游引物為5’-GATGACTGTATGACTCTCAG-3’，下游引物為5’-AGTGTACTACATAGTACG-3’。采集所有研究對象空腹靜脈血5 mL，分離血清，-80 ℃低溫冰箱保存待測。RTFQ-PCR在ABI 7500 RTFQ-PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20.00 μL：TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μL，cDNA 1.33 μL，ddH2O 7.67 μL，混合后離心放入RTFQ-PCR儀。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃復(fù)性60 s，45個循環(huán)，實(shí)驗重復(fù)3次。采用2-△△Ct法（△Ct=Ct目的基因-CtU6）計算miR-135及miR-601的相對表達(dá)水平。

1.2.3 CA72-4及CA19-9檢測

采用化學(xué)發(fā)光法測定CA72-4及CA19-9水平，在羅氏E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較

與非胃癌組和對照組比較，胃癌組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平均明顯升高（P＜0.001）。與對照組比較，非胃癌組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平無明顯升高，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較Tab.1 Comparison of serum levels of miR-135,miR-601,CA72-4 and CA19-9 in each group

2.2 進(jìn)展期胃癌組和早期胃癌組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較

與早期胃癌組比較，進(jìn)展期胃癌組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平明顯升高（P＜0.001，表2）。

2.3 不同TNM分期胃癌患者血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較

Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.4 兩組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較

與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平明顯升高（P＜0.001，表4）。

2.5 血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平對早期胃癌的診斷價值

血清miR-1 3 5、miR-6 0 1、CA 7 2-4及CA19-9水平診斷早期胃癌的最佳截斷值分別為3.78、7.14、17.63 U/mL、35.70 U/mL，四項聯(lián)合診斷早期胃癌的AUC（0.920，95% CI：0.860～0.978）明顯高于單項miR-135（0.804，95% CI：0.748～0.862）、miR-601（0.846，95% CI：0.787～0.906）、CA72-4（0.815，95%CI：0.754～0.873）及CA19-9（0.714，95% CI：0.658～0.776），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=5.417、4.938、5.108、7.804，P＜0.05），其靈敏度和特異度為98.6%和77.4%（表5和圖2）。

表2 進(jìn)展期胃癌組和早期胃癌組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較Tab.2 Comparison of serum levels of miR-135,miR-601,CA72-4 and CA19-9 between advanced gastric cancer group and early gastric cancer group

表3 不同TNM分期胃癌患者血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較Tab.3 Comparison of serum levels of miR-135,miR-601,CA72-4 and CA19-9 in patients with gastric cancer of different TNM stages

表4 兩組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平比較Tab.4 Comparison of serum levels of miR-135,miR-601,CA72-4 and CA19-9 between lymph node metastasis group and non-lymph node metastasis group（x±s）

表5 血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平對早期胃癌的診斷價值Tab.5 Diagnostic value of serum levels of miR-135,miR-601,CA72-4 and CA19-9 in early gastric cancer

圖1 血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平診斷早期胃癌的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-135,miR-601,CA72-4 and CA19-9 in the diagnosis of early gastric cancer

2.6 胃癌患者血清miR-135、miR-601水平與CA72-4及CA19-9的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌患者血清miR-135水平與CA72-4及CA19-9均呈正相關(guān)（r=0.748，P＜0.001，r=0.694，P＜0.001），miR-601水平與CA72-4及CA19-9均呈正相關(guān)（r=0.815，P＜0.001，r=0.716，P＜0.001，圖2）。

圖2 血清miR-135、miR-601水平與CA72-4及CA19-9的相關(guān)性Fig.2 Correlation of serum miR-135 and miR-601 levels with CA72-4 and CA19-9

3 討 論

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，CA72-4及CA19-9是常用的傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于胃癌的診斷、轉(zhuǎn)移監(jiān)測及預(yù)后判斷［7］，但這些腫瘤標(biāo)志物在早期胃癌診斷中的靈敏度較低，單項指標(biāo)診斷早期胃癌的價值有限，聯(lián)合應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物對于早期胃癌的診療提供了新的思路。miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，其調(diào)控靶基因的表達(dá)參與細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及分化，對惡性腫瘤診斷及指導(dǎo)治療具有很大的幫助［8］。近期的研究表明，在多種惡性腫瘤中存在miR-135及miR-601的異常表達(dá)，有可能作為惡性腫瘤的診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)［9-10］。

本研究顯示，與非胃癌組和對照組比較，胃癌組血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平均明顯升高，而與非胃癌組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平在胃癌患者中異常高表達(dá)，其可能具有癌基因的作用，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。有研究顯示，miRNA有可能是一類新的癌基因，在胃癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11］。Yu等［12］研究也發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清CA72-4及CA19-9水平高于胃良性疾病組和對照組，而胃良性疾病組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示其水平變化與胃癌進(jìn)程有關(guān)。本研究中血清miR-135及miR-601水平在進(jìn)展期胃癌組明顯高于早期胃癌組，在Ⅲ～Ⅳ期患者明顯高于在Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示miR-135及miR-601在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用，其高表達(dá)對促進(jìn)胃癌的病情進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b在胃癌組織中的表達(dá)水平升高，miR-135b的高表達(dá)與分化程度、浸潤深度和TNM分期密切相關(guān)，可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展［13］。Kong等［14］研究表明，miRNA在胃癌患者中明顯升高，腫瘤復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與miRNA表達(dá)密切相關(guān)，是影響胃癌患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

本研究ROC曲線顯示，血清miR-135、miR-601、CA72-4及CA19-9水平診斷早期胃癌的最佳截斷值分別為3.78、7.14、17.63 U/mL、35.70 U/mL，四項聯(lián)合診斷早期胃癌的AUC（0.920，95% CI：0.860～0.978）最大，其靈敏度較高。相關(guān)分析顯示，胃癌患者血清miR-135、miR-601水平與CA72-4及CA19-9均呈正相關(guān)（P＜0.001）。這說明miR-135及miR-601有望作為診斷早期胃癌的新型生物標(biāo)志物，四項聯(lián)合檢測有助于提高早期胃癌診斷的靈敏度。Yin等［15］研究顯示，miR-135在胃癌患者中明顯升高，其高表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物CA19-9相關(guān)，對胃癌診斷具有較好的價值。Min等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-601在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對照組，miR-601的高表達(dá)可促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，是胃癌患者生存率低的一個新的指標(biāo)，有可能作為胃癌預(yù)后預(yù)測的生物學(xué)標(biāo)志物。另有研究表明，胃癌發(fā)生、發(fā)展與血清miRNA表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)，對胃癌診斷的價值較好，miRNA有望作為一種非侵入性生物標(biāo)志物應(yīng)用于早期胃癌的篩查［17］。

綜上所述，胃癌患者血清miR-135及miR-601表達(dá)水平明顯升高，且與胃癌的進(jìn)展相關(guān)，聯(lián)合傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CA72-4及CA19-9檢測有助于提高胃癌早期診斷的靈敏度，同時也為了解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。