張曉慧，羅建民，索曉慧，孫國鋒，劉洪峰，李 靜，牛廣旭

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 邯鄲 056001；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050000；

3.河北省邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 邯鄲 056001；

4.河北省邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北 邯鄲 056001

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）基因是細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子家族中的重要成員，是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白，它通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮生物學(xué)功能。SOCS1被公認(rèn)為抑癌基因，近年多項研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1的啟動子是位于該基因5’端功能區(qū)的CpG島，它的表觀遺傳學(xué)修飾會導(dǎo)致SOCS1表達(dá)沉默，表達(dá)沉默的SOCS1基因在致癌過程中發(fā)揮重要的作用［1］，特別是在造血系統(tǒng)的惡性腫瘤和增殖性疾病中［2］。本研究旨在明確SOCS1基因的甲基化和組蛋白去乙?；率蛊浔磉_(dá)沉默與急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2016年2月—2018年12月邯鄲市中心醫(yī)院血液內(nèi)科和河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科收治的110例AML患者和10名健康志愿者?；颊叩囊话闱闆r見表1。初治（initial treatment，IT）組為AML初次就診未進(jìn)行任何治療的患者，復(fù)發(fā)難治（relapsed/refractory，RR）組為治療后再次復(fù)發(fā)或兩個療程仍未緩解的AML患者，緩解（remission，RE）組為經(jīng)過治療后達(dá)到完全緩解的患者，正常對照組（normal control group，NC）為健康志愿者。AML的診斷和分型按照法國-美國-英國（French-American-British，F(xiàn)AB）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，包括M0（2例）、M1（9例）、M2（50例）、M4（36例）、M5（13例）。研究標(biāo)本均取自骨髓單個核細(xì)胞。

1.2 隨訪觀察指標(biāo)

從疾病確診之日開始計算生存期，對所有患者采用電話、門診、住院等方式隨訪至2019年8月31日。總生存期（overall survival，OS）定義為患者從確診開始至死亡的日期（月），無事件生存期（event-free survival，EFS）定義為患者從接受治療開始至疾病進(jìn)展、反復(fù)或死亡的日期（月）。完全緩解（complete remission，CR）按照美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）評價標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

AML細(xì)胞系U937和THP-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。U937和THP-1細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（美國Gibco公司）的RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培育箱中溫育，每2～3 d換液傳代。

表1 研究對象的一般情況Tab.1 Characteristics of patients

1.4 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖

將U937和THP-1細(xì)胞系接種于96孔板中，密度為1×104個細(xì)胞/孔，用不同濃度的去甲基化藥物5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-azaC；美國Sigma公司）和組蛋白去乙?；敢种苿┪鬟_(dá)本胺（美國CSNpharm公司）處理兩種白血病細(xì)胞系，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h，使用酶標(biāo)儀測量波長450 nm處的吸光度（D）值。制作細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)增殖率曲線，最終選取5-azaC 2.0和5.0 μmol/L干預(yù)U937細(xì)胞，干預(yù)THP-1細(xì)胞的濃度為20.0和50.0 μmol/L，西達(dá)本胺干預(yù)U937細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的濃度為0.5和1.0 μmol/L，培養(yǎng)時間為48 h。兩藥聯(lián)合時低濃度組和高濃度組中5-azaC和西達(dá)本胺濃度、培養(yǎng)時間均不變。同時設(shè)置空白組和對照組，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MS-PCR）

RNA和DNA均提取自骨髓單個核細(xì)胞或細(xì)胞系，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書［天根生化科技（北京）有限公司］進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照DNA甲基化試劑盒說明書（美國Zymo Research Biotech公司）進(jìn)行基因的甲基化處理。PCR擴(kuò)增條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，10 s，60 ℃，20 s，72 ℃，15 s，40個循環(huán)；72 ℃，7 min。β-actin為內(nèi)參。ΔΔCt方法分析基因的相對表達(dá)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。甲基化PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色并在UV照射下顯現(xiàn)。引物序列見表2。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法 （Western blot）檢測蛋白水平

用冰磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞3次，然后用RIPA緩沖液溶解細(xì)胞。用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離50 μg總蛋白，將裂解物轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用SOCS1（1∶1 000）、DNMT1（1∶1 000）、DNMT3a （1∶1 000）、HDAC1（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）（美國Cell Signaling Technology公司）的抗體對膜進(jìn)行4 ℃溫育，隨后與二抗共同溫育1 h，洗滌后進(jìn)行膠片顯影。Sicon Image J軟件對其蛋白水平進(jìn)行半定量分析，計算蛋白和內(nèi)參蛋白的相對積分光密度（integral optical density，IOD）值來顯示其相對表達(dá)量。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

1.7 基因敲除

將U937和THP-1細(xì)胞接種在6孔板上，在培養(yǎng)孔中接種濃度為2×105個/mL的細(xì)胞。抑制DNMT1基因的小干擾RNA（DNMT1-siRNA）序列為：5’-GGGAGAAAUUAAACUUACUTT-3’和5’-AGUAAGUUUAAUUUCUCCCTT-3’。用不靶向任何基因的siRNA序列作為干擾序列對照。培養(yǎng)孔中加入DNMT1-siRNA和Lipofectamine RNAiMax（美國Invitrogen公司)，37 ℃共同溫育48 h，同時設(shè)置空白對照孔。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AML各組中SOCS1基因mRNA的表達(dá)及甲基化狀態(tài)

在IT組和RR組中SOCS1 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于RE組和NC組（P＜0.05），RR組中的表達(dá)低于IT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。AML IT組中SOCS1基因甲基化者有24例（48%，24/50），RR組中有8例（80%，8/10），而在RE組和NC組均為非甲基化狀態(tài)甲基化率為0%（0/50）和0%（0/10），SOCS1基因甲基化率在IT組和RR組中顯著高于RE組和NC組（圖2）。

圖1 SOCS1基因mRNA的相對表達(dá)水平Fig.1 Relative expression of SOCS1 mRNA in IT,RR,RE and NC groups

圖2 SOCS1基因甲基化狀態(tài)Fig.2 SOCS1 gene methylation status in IT,RR,RE and NC groups

2.2 SOCS1甲基化、組蛋白去乙?；嚓P(guān)基因的表達(dá)

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）和DNMT3a及組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 1，HDAC1）的mRNA在AML IT組和RR組中表達(dá)顯著高于RE組和NC組（P＜0.05）。IT組和RR組中表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，RE組和NC組中表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

圖3 DNMT1,DNMT3a and HDAC1 mRNA的相對表達(dá)水平Fig.3 mRNA relative expressions of DNMT1,DNMT3a and HDAC1

AML IT組和RR組中SOCS1蛋白相對表達(dá)量比RE組和NC組顯著減少（P＜0.05），而DNMT1、DNMT3a和HDAC1蛋白相對表達(dá)量在RE組和NC組顯著低于IT組和RR組（P＜0.05，圖4）。

2.3 SOCS1甲基化與AML患者預(yù)后的相關(guān)性

將AML IT根據(jù)有無SOCS1的甲基化分為甲基化組和非甲基化組，分別檢測兩組患者CR、EFS和OS的差異。SOCS1甲基化組中治療后CR明顯低于非甲基化組（P＜0.05），但兩組間EFS和OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

2.4 藥物干預(yù)AML細(xì)胞系后SOCS1基因表達(dá)和甲基化狀態(tài)的變化

隨著5-azaC和西達(dá)本胺濃度的增加，SOCS1 mRNA的表達(dá)量逐漸增加，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。5-azaC干預(yù)后U937和THP-1細(xì)胞株中SOCS1基因甲基化條帶逐漸減弱，非甲基化條帶逐漸增強(qiáng)，由完全甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆羌谆癄顟B(tài)（圖6）。

2.5 藥物干預(yù)AML細(xì)胞系后甲基化、組蛋白去乙?；嚓P(guān)基因的表達(dá)水平

5-azaC處理白血病細(xì)胞系后，SOCS1基因mRNA表達(dá)增多，DNMT1、DNMT3a表達(dá)較無藥物處理組明顯下降（P＜0.05）；西達(dá)本胺處理白血病細(xì)胞系后，SOCS1基因mRNA表達(dá)同樣升高，HDAC1表達(dá)較無藥物處理組明顯下降（P＜0.05），而在同時有5-azaC和西達(dá)本胺的處理組，SOCS1基因較同濃度單藥組升高更加明顯（P＜0.05），且DNMT1、DNMT3a、HDAC1表達(dá)均較同濃度單藥組下降更加明顯（P＜0.05，圖7）。

圖4 蛋白相對水平Fig.4 Relative level of protein

圖5 SOCS1甲基化對AML患者CR、EFS和OS預(yù)后的影響Fig.5 The prognostic value of SOCS1 methylation for CR,EFS and OS among AML patients

圖6 藥物處理后SOCS1的改變Fig.6 Changes of SOCS1 after drug treatment

2.6 藥物干預(yù)AML細(xì)胞株后細(xì)胞增殖率結(jié)果

5-azaC對U937和THP-1細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（the half maximal inhibitory concentrations，IC50)分別為0.92和13.65 μmol/L；西達(dá)本胺對U937和THP-1細(xì)胞系的IC50分別為0.17和0.42 μmol/L；兩藥組對U937（5-azaC∶西達(dá)本胺為4∶1配制）和THP-1（5-azaC∶西達(dá)本胺chidamide為40∶1配制）細(xì)胞系的IC50分別為5-azaC 0.85 μmol/L、西達(dá)本胺0.21 μmol/L和5-azaC 11.25 μmol/L、西達(dá)本胺0.28 μmol/L。隨著5-azaC和西達(dá)本胺濃度的增加，兩種白血病細(xì)胞系U937和THP-1的增殖率逐漸下降，隨藥物處理時間的延長，細(xì)胞增殖率也在逐漸下降（圖8～9）。

2.7 敲除DNMT1基因

U937和THP-1細(xì)胞系轉(zhuǎn)染入DNMT1-siRNA后，細(xì)胞內(nèi)DNMT1基因mRNA和蛋白的表達(dá)均較前下降，而SOCS1基因mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯升高。白血病細(xì)胞增殖曲線隨轉(zhuǎn)染時間推移開始逐漸上升（圖10～11）。

圖7 AML細(xì)胞系中表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.7 Changes of epigenetic gene expression in AML lines

圖8 藥物干預(yù)AML細(xì)胞系后增殖率濃度的變化Fig.8 Cell viability of AML cell lines after demethylation treatment

圖9 AML細(xì)胞系增殖曲線Fig.9 Cell proliferation curves of AML cell lines

圖10 AML細(xì)胞系轉(zhuǎn)染DNMT1-siRNA后SOCS1、DNMT1基因變化Fig.10 Changes of SOCS1 and DNMT1 gene expressions in AML lines transfected with DNMT1-siRNA

圖11 轉(zhuǎn)染DNMT1-siRNA后AML細(xì)胞系的增殖曲線Fig.11 Cell proliferation curves of AML lines transfected with DNMT1-siRNA

3 討 論

在腫瘤的發(fā)生過程中，細(xì)胞表觀基因組發(fā)生了關(guān)鍵性的改變，表觀遺傳學(xué)修飾僅改變基因的表達(dá)但不影響基因序列，意味著基因表觀遺傳學(xué)修飾與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3-5］?；蛲蛔儼ㄒ职┗蚝桶┗虻耐蛔儯蠖枷蚣?xì)胞增殖失控的方向傾斜。表觀遺學(xué)修飾更為復(fù)雜，主要包括DNA甲基化、組蛋白去乙?；⑷旧|(zhì)重塑和非編碼RNA［6］。其中抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化和組蛋白去乙?；谀[瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用［7-8］。

SOCS1被公認(rèn)為抑癌基因，在肝細(xì)胞癌中甲基化發(fā)生率高達(dá)39%～60%，且與肝癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及疾病進(jìn)展相關(guān)［9］。SOCS1的甲基化還發(fā)生于其他腫瘤性疾病中，例如61%的子宮頸癌［10］，45%的食管鱗狀細(xì)胞癌［11］，40%的肝母細(xì)胞癌［12］等。隨后，在胃腸道腫瘤、胰腺腫瘤等疾病中都相繼有SOCS1基因被高度甲基化的研究報道。Kim等［13］在對宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SOCS1的表達(dá)沉默不僅與其啟動子區(qū)的甲基化有關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)與基因的組蛋白去乙?；嘘P(guān)，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理后，SOCS1的表達(dá)明顯增高，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［14］。

最近的研究［15-17］表明，SOCS1可上調(diào)多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌中微小RNA的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了SOCS1作為腫瘤抑制基因的作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，在AML的發(fā)生中SOCS1的甲基化、組蛋白去乙?；l(fā)揮重要的作用。在疾病初治組和復(fù)發(fā)難治組中SOCS1基因的甲基化（甲基化率為48%和80%）導(dǎo)致mRNA和蛋白的表達(dá)減少，SOCS1基因的甲基化與該基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。同時，DNMT1、DNMT3a和HDAC1隨之升高，與SOCS1甲基化率及表達(dá)減低趨勢一致，提示DNMT1、DNMT3a和HDAC1基因可能參與了SOCS1表觀遺傳學(xué)修飾的過程，致使SOCS1基因表達(dá)沉默。而在RE和NC中，SOCS1基因均為非甲基化狀態(tài)且其mRNA和蛋白的表達(dá)量均較高，且在初治AML患者中SOCS1非甲基化組CR明顯高于甲基化組，但兩組間EFS和OS無顯著性差異，說明SOCS1基因的表觀遺傳學(xué)改變與白血病的診斷、治療緩解有相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)對AML細(xì)胞系U937和THP-1進(jìn)行了去甲基化和抑制基因組蛋白去乙?；难芯?，用去甲基化藥物5-氮雜胞苷干預(yù)兩種AML細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)SOCS1基因由原本的甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆癄顟B(tài)，mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，呈藥物濃度依賴性，組蛋白去乙酰化抑制劑西達(dá)本胺干預(yù)兩種細(xì)胞系后，SOCS1基因表達(dá)也出現(xiàn)升高，甲基化相關(guān)基因DNMT1、DNMT3a和HDAC1的mRNA和蛋白相對表達(dá)量逐漸減少，而腫瘤細(xì)胞的增殖率隨之下降。本研究發(fā)現(xiàn)，在同時有5-氮雜胞苷和西達(dá)本胺的處理組，SOCS1基因表達(dá)升高程度更加明顯，對DNMT1、DNMT3a、HDAC1基因的抑制作用更強(qiáng)。同時應(yīng)用去甲基化藥物和組蛋白去乙?；种苿?，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。將可干擾DNMT1基因表達(dá)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染入U937和THP-1細(xì)胞系內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)，隨著DNMT1基因表達(dá)受到抑制，SOCS1基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，而AML細(xì)胞系增殖受到抑制。DNMT1基因敲除使SOCS1基因啟動子甲基化減弱，上調(diào)了SOCS1的表達(dá)，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。提示在AML中，通過抑制SOCS1基因的表觀遺傳學(xué)修飾以提高該基因表達(dá)可以起到抑制腫瘤發(fā)展促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

因此，本研究證實(shí)，SOCS1作為AML診斷、治療緩解和預(yù)后的標(biāo)志物具有一定的可靠性和特異性?；謴?fù)或提高SOCS1表達(dá)的方法或許可作為抗癌療法［18-19］，但在其他種類的腫瘤中SOCS1是否均發(fā)揮抑癌作用，仍需要通過對不同種類腫瘤的研究來進(jìn)一步證實(shí)。