□ 李 洋 辛偉娟 史麗新 孫鈞儒 侯世松 朱希敏 煙臺(tái)喜旺肉類食品有限公司

“瘦肉精”是一種特定的可用來減少被飼養(yǎng)動(dòng)物脂肪、增加其瘦肉比例的藥物的俗稱。傳統(tǒng)型瘦肉精一般是指β－受體激動(dòng)劑，是一類人工合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，包括克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、異丙喘寧、氯丙那林、西馬特羅與非諾特羅等，其中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺最為常見。該類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留會(huì)對(duì)消費(fèi)者的身體造成不同程度的影響，對(duì)于易感人群危害更為嚴(yán)重[1—2]。2002年，β －受體激動(dòng)劑被列入《食用動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》[3]。

現(xiàn)階段，對(duì)β－受體激動(dòng)劑和喹乙醇及其代謝物的檢測(cè)方法較多。劉佳等[4]建立了一種檢測(cè)豬肝中26種β2—受體激動(dòng)劑藥物殘留的反相液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法；金玉娥等[5]也采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定了豬肉和豬肝中11種β2—受體激動(dòng)劑，上述檢測(cè)方法取得了比較理想的結(jié)果。但上述研究的前處理過程都比較復(fù)雜，一般包括酶解、提取、固相萃取的過程，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

GB/T 21313—2007[6]的檢驗(yàn)方法中用高氯酸溶液進(jìn)行提取，眾所周知，高氯酸為強(qiáng)氧化易爆品，具有較高的危險(xiǎn)性，在實(shí)驗(yàn)室使用具有較大的安全隱患。本研究對(duì)GB/T 21313—2007的檢驗(yàn)方法進(jìn)行調(diào)整，用鹽酸溶液代替高氯酸溶液進(jìn)行提取，簡(jiǎn)化過柱凈化程序，提高實(shí)驗(yàn)效率，降低上機(jī)液雜峰干擾。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原理

試樣中β—受體激動(dòng)劑殘留經(jīng)酶解后，再用鹽酸溶液提取，經(jīng)過濾和離心后，上清液用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)峰面積法定量。

1.2 試驗(yàn)儀器

液相色譜Agilent1200；二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜Agilent6410；萬分之一分析天平；水浴鍋。

1.3 試劑

甲酸（99%）；乙腈，色譜純；甲醇，色譜純；乙酸，分析純，乙酸 鈉（NaAc·4H2O）； 鹽 酸 克 倫 特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.010 0 g標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純≥99.5%），用甲醇溶解并定容至10 mL，即可得濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，—18 ℃保存，有效期12個(gè)月。若購買的標(biāo)準(zhǔn)品為溶液，則直接稀釋為標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要，用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液應(yīng)使用前配制。

2 驗(yàn)證過程

2.1 試驗(yàn)步驟

2.1.1 提取

準(zhǔn)確稱取10 g樣品，加15 mL乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH=5.2），渦旋后超聲10 min。再加入β—葡糖醛酸酐肽酶100 μL，于（37±1）℃震蕩酶解過夜。取出冷卻后，放入75 ℃水浴10 min，加入20 mL 0.2 M鹽酸，渦旋，超聲10 min，離心。

2.1.2 MCX柱凈化

MCX柱使用前用3 mL甲醇、3 mL水活化。取樣液過柱，棄去濾液，依次用3 mL水、2 mL甲醇淋洗，最后用3.5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈珊?，?%乙腈水（0.1%甲酸）1 mL定容，渦旋，過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

2.1.3 上機(jī)條件

2.1.3.1 液相色譜條件

色 譜 柱：SB—C18柱，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A水（含0.1%甲酸）；B乙腈；流速：0.25 mL/min，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫表

2.1.3.2 監(jiān)測(cè)離子對(duì)及能量

檢測(cè)過程中的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 驗(yàn)證參數(shù)

2.2.1 定性限

參 考 GB/T 21313—2007定 性 限0.1 μg/kg，以陰性樣品為測(cè)試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分別為0.1 μg/kg，在相同實(shí)驗(yàn)條件下做3個(gè)平行樣，計(jì)算信噪比、離子豐度是否滿足要求。

保留時(shí)間：試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間應(yīng)一致，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。信噪比：待測(cè)化合物的定性離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于3（S/N≥3）。

定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差見表3。

2.2.2 定量限

參 考 GB/T 21313—2007 定 性 限0.3 μg/kg，以陰性樣品為測(cè)試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺與沙丁胺醇添加水平分別為0.3 μg/kg，在相同實(shí)驗(yàn)條件下做3個(gè)平行樣，計(jì)算信噪比、保留時(shí)間是否滿足要求。

表3 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

保留時(shí)間：試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間一致，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。信噪比：待測(cè)化合物的定量離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比贏大于等于10（S/N≥10）。

2.2.3 回收率

以陰性樣品為測(cè)試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分別為0.3、0.6、1.0 μg/kg與3.0 μg/kg，每個(gè)水平在相同實(shí)驗(yàn)條件下做6個(gè)平行樣，計(jì)算回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.2.4 精密度

以陰性樣品為測(cè)試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分別為0.3、0.6、1.0 μg/kg與3.0 μg/kg每個(gè)水平在相同實(shí)驗(yàn)條件下做6個(gè)平行樣，計(jì)算實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)。

2.2.5 線性范圍

分別取 0.1、0.8、1.5、2.0 μg/L與3.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 定性限

按照試驗(yàn)步驟，對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)，信噪比、相對(duì)離子豐度偏差如表4。

3個(gè)平行樣的保留時(shí)間、信噪比、相對(duì)離子豐度均滿足要求，能達(dá)到要求的定性限。

3.2 定量限

按照試驗(yàn)步驟，對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)，信噪比、相對(duì)離子豐度偏差如表5。

表4 定性限相關(guān)參數(shù)

表5 定性限相關(guān)參數(shù)

3個(gè)平行樣的保留時(shí)間、信噪比、相對(duì)離子豐度均滿足要求，能達(dá)到要求的定性限要求。

3.3 回收率

按照實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)3個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行了4個(gè)水平的添加回收，具體數(shù)據(jù)見表6～8。

4個(gè)添加水平的回收率均能滿足GB/T 27404—2008中 的 被 測(cè) 組分含量＜0.1 mg/kg時(shí)回收率在60%～120%要求。

3.4 精密度

對(duì)不同添加水平的樣品在相同實(shí)驗(yàn)條件下做6個(gè)平行樣，計(jì)算變異系數(shù)。具體數(shù)據(jù)見表9～11。

表6 沙丁胺醇回收率

表7 萊克多巴胺回收率

表8 鹽酸克倫特羅回收率

表9 沙丁胺醇精密度相關(guān)數(shù)據(jù)

表10 萊克多巴胺精密度相關(guān)數(shù)據(jù)

表11 鹽酸克倫特羅精密度相關(guān)數(shù)據(jù)

所添加水平的結(jié)果符合GB/T 27404—2008 中規(guī)定的 10 μg/kg 以下變異系數(shù)小于21%的要求。

3.5 線性范圍

分別取 0.1、0.8、1.5、2.0 μg/L與3.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1～3，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的濃度在0.1～3.0 μg/L的范圍內(nèi)與響應(yīng)值呈線性關(guān)系。

圖1 沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線

4 結(jié)論

經(jīng)過上述參數(shù)驗(yàn)證，本研究所采用的檢測(cè)方法，符合GB/T 21313—2007、GB/T 27404—2018的要求，可以用于動(dòng)物源性食品中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的檢測(cè)。本方法安全性高，操作快捷簡(jiǎn)單，靈敏度較高，重復(fù)性好，能夠用于應(yīng)急檢測(cè)或日常豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺殘留的監(jiān)測(cè)，也為動(dòng)物源食品中不同性質(zhì)的獸藥殘留的高通量快速分析檢測(cè)提供了一定的技術(shù)參考[7]。