□ 柯粵振 伍 鎣 續(xù) 穎 李逸純 廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司

天然油發(fā)酵是醬油生產(chǎn)過程中的重要工序，向成曲中加入一定量的水或者鹽水，經(jīng)攪拌后裝入發(fā)酵容器中，并保持一定的溫度，利用微生物和微生物所分泌的各種酶將復(fù)雜的有機(jī)物分解成簡(jiǎn)單的有機(jī)物的生化變化過程即為天然油發(fā)酵過程，醬油獨(dú)特的風(fēng)味就是在發(fā)酵和老化過程中逐漸形成的[1]。

天然油發(fā)酵過程中會(huì)形成大量游離氨基酸[1]，游離氨基酸的產(chǎn)生使醬油具有特有的風(fēng)味[2—3]，其中游離谷氨酸是主要的鮮味物質(zhì)[2—4]，能賦予醬油鮮美的味道，準(zhǔn)確測(cè)定天然油中游離谷氨酸的含量對(duì)醬油營養(yǎng)價(jià)值的提升具有積極意義。同時(shí)在天然油發(fā)酵過程中也會(huì)析出一種白色的物質(zhì)附著在豆粒的表層，并逐漸形成圓形或片狀的白色顆粒，俗稱“白點(diǎn)”[5]，它的存在嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的外觀。這些白點(diǎn)以酪氨酸為主，由多種氨基酸共同結(jié)晶而成[6]，準(zhǔn)確測(cè)定天然油中游離酪氨酸的含量對(duì)改良醬油品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(2.5 μmol/mL)：美國sigma公司；三氯乙酸：分析純；緩沖液 B1、B2、B3、B4、B6：日本日立公司；茚三酮溶液R1、R2：日本日立公司；鹽酸：優(yōu)級(jí)純。

1.2 儀器和設(shè)備

L—8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確吸取1 mL混合均勻的天然油于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L的HCl稀釋定容至50 mL，搖勻。再取2 mL稀釋液于5 mL離心管中，加入2 mL 1%三氯乙酸溶液去除蛋白質(zhì)，10 000 r/min離心5 min，離心后上清液過0.22 μm濾膜進(jìn)樣分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（2.5 μmol/mL）用0.02 mol/L鹽酸溶液稀釋至0.1 nmol/μL 與 0.25 nmol/μL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，強(qiáng)制過原點(diǎn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：日立鈉離子交換樹脂4.6 mm×60 mm；測(cè)定波長(zhǎng)：570 nm和440 nm；柱溫：57 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相按梯度表（表 1）進(jìn)行洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)1.3.2方法配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，分別繪制谷氨酸、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1、圖2），強(qiáng)制過原點(diǎn)后相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999，說明在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。氨基酸標(biāo)樣色譜圖（見圖3），出峰時(shí)間為30 min，所有氨基酸都得到了良好的分離，其中谷氨酸、酪氨酸的保留時(shí)間分別為6.813 min和18.287 min。

圖1 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 氨基酸標(biāo)樣色譜圖（0.1 nmol/μL）

2.2 精密度

準(zhǔn)確吸取天然油樣品6份，在相同條件下進(jìn)行樣品處理和進(jìn)樣分析，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果（見表2），酪氨酸、谷氨酸的CV均小于2%，表明方法的重現(xiàn)性較好。

表2 天然油平行測(cè)定6次結(jié)果

2.3 加標(biāo)回收率

將一定量標(biāo)樣加入到天然油樣品中，然后與未加標(biāo)樣的天然油平行進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析，根據(jù)酪氨酸、谷氨酸的測(cè)定值、計(jì)算回收率，結(jié)果（見表3），酪氨酸、谷氨酸回收率均在90%以上，說明測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，該方法可以用于天然油中游離酪氨酸、游離谷氨酸的定量分析。

表3 酪氨酸、谷氨酸回收率

2.4 樣品的測(cè)定

采用本方法測(cè)定天然油樣品，色譜圖（見圖4），測(cè)定結(jié)果（見表4），酪氨酸、谷氨酸與其他組分分離良好，峰型好，干擾小。說明本方法比較適合測(cè)定天然油中的游離酪氨酸、游離谷氨酸的含量。

圖4 天然油游離氨基酸色譜圖

表4 天然油游離谷氨酸、游離酪氨酸測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本方法采用三氯乙酸去除天然油中蛋白后，用自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定游離酪氨酸與游離谷氨酸的含量，操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、回收率高、干擾小，是準(zhǔn)確快速測(cè)定天然油中游離酪氨酸、游離谷氨酸的可靠方法。本方法對(duì)醬油工藝改良、品質(zhì)提升的研究具有重要意義。