張牧 張玉 楊紅梅 代二琴 宋新強(qiáng)

1.信陽(yáng)師范學(xué)院醫(yī)院，河南 信陽(yáng)464000；2.信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng)464000；3.北京體育大學(xué)學(xué)術(shù)期刊社，北京100084

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第三，死亡率高［1，2］。目前，治療OC 的手段多采用手術(shù)和化療相結(jié)合的綜合治療方法［3-5］，但化學(xué)藥物有一定的毒性，有時(shí)產(chǎn)生耐藥性，中藥在這方面則具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［6-9］。淫羊藿（Epimedium brevicornum）始載《神農(nóng)本草經(jīng)》［10-12］。歷史悠久，藥用價(jià)值高，具有“補(bǔ)命門(mén)，益精氣，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，補(bǔ)腎陽(yáng)”等作用［13-16］?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，淫羊藿具有免疫抑制、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用［17-25］。

在中醫(yī)藥研究中，分析中藥有效成分治療疾病的機(jī)理是一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為多組分、多靶點(diǎn)、多通路藥物的研究和分析提供了良好的平臺(tái)［26-29］。IPA（ingenuity pathway anaylsis）生物分析軟件能夠很好地分析和整合基因組、代謝組、蛋白質(zhì)組、芯片、小分子RNA、單核苷酸多態(tài)性和各種小規(guī)模實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，并構(gòu)建相互作用模型。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）是一個(gè)獨(dú)特的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)，可以從中獲得藥物、靶蛋白和疾病之間的關(guān)系。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法，探討淫羊藿治療OC的潛在靶點(diǎn)和信號(hào)途徑，預(yù)測(cè)了淫羊藿發(fā)揮作用的信號(hào)通路靶點(diǎn)，旨在獲取更詳細(xì)的淫羊藿治療OC 的機(jī)理信息。見(jiàn)圖1。

1 材料和方法

1.1 淫羊藿靶向蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)及OC 相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 從TCMSP（截止2019 年11 月1 日）和Swiss Target Prediction database（截止2019 年11 月1 日）搜索“淫羊藿（epimrdii herba）”，并以“口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18”為條件對(duì)淫羊藿的所有成分進(jìn)行篩選，得到淫羊藿的主要活性物質(zhì)以及各自作用的靶蛋白名稱(chēng)，從數(shù)據(jù)庫(kù)Dis GeNET（截止2019年11 月1 日）使用搜索條目“ovarian cancer”來(lái)搜索與OC 相關(guān)的基因，并對(duì)搜索結(jié)果進(jìn)行篩選，只保留與人類(lèi)相關(guān)的基因，建立卵巢癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 淫羊藿靶點(diǎn)蛋白以及OC 相關(guān)基因通路和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的淫羊藿靶點(diǎn)蛋白以及OC 相關(guān)基因按照symbols 信息上傳到IPA 分析平臺(tái)，信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò)通過(guò)到IPA 和STRING 獲取。

1.3 淫羊藿作用靶點(diǎn)以及OC 相關(guān)基因共同的通路和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了更加明確OC 相關(guān)靶點(diǎn)與淫羊藿主要活性成分潛在靶點(diǎn)之間的相互作用，將OC 相關(guān)靶點(diǎn)與淫羊藿主要活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，將疾病靶點(diǎn)與藥物活性成分靶點(diǎn)輸入Venny2.1.0 軟件繪制韋恩圖。并將篩選得到的疾病-藥物成分共同靶蛋白輸入STRING 11.0 平臺(tái)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein intteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將Organism 設(shè)置為“Homo sapiens”，將最低相互作用閾值設(shè)置為中等“highest confidence（0.900）”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。

圖1 淫羊藿治療卵巢癌分析流程圖

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿主要活性成分及靶標(biāo)蛋白 通過(guò)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選，得到了23 種主要活性成分。見(jiàn)表1。每種成分均有蛋白靶點(diǎn)，共有219 個(gè)靶點(diǎn)蛋白，整理后得到與人相關(guān)的共有200 個(gè)，通過(guò)在NCBI 中搜索找到各自相應(yīng)的Gene ID 以及Symbol。見(jiàn)表2。

2.2 淫羊藿作用靶點(diǎn)的信號(hào)通路與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用IPA 軟件構(gòu)建了包含淫羊藿的主要活性成分靶蛋白的信號(hào)通路和相互作用網(wǎng)絡(luò)。淫羊藿主要活性成分的靶蛋白共構(gòu)建了376 個(gè)信號(hào)通路和24 個(gè)功能不同的網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2（列舉前10 個(gè)通路）。這些通路及其形成的網(wǎng)絡(luò)主要集中“細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，結(jié)締組織發(fā)育與功能，組織發(fā)育，細(xì)胞死亡與存活，機(jī)體損傷與異常，DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，分子轉(zhuǎn)運(yùn)”等方面，表明了這些靶蛋白可能參與癌癥的形成以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡過(guò)程的調(diào)控。

表1 淫羊藿主要活性成分

2.3 OC 相關(guān)基因生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)及功能 通過(guò)檢索NCBI中的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到了1650 個(gè)人OC 相關(guān)基因，見(jiàn)表3（列舉了前20 個(gè)）。在IPA 軟件中引入OC 相關(guān)基因可以構(gòu)建25 個(gè)分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，這些分子主要涉及379 個(gè)信號(hào)通路，其中涉及OC 相關(guān)基因最多的是癌癥的分子機(jī)制、胰腺癌信號(hào)通路、糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)通路等3 個(gè)信號(hào)通路，見(jiàn)圖3（列舉前10 個(gè)通路）。

2.4 共同參與通路和相互作用分子網(wǎng)絡(luò) 利用IPA軟件的比較模塊，比較了淫羊藿主要活性成分的靶蛋白和OC 相關(guān)基因的分子網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)途徑。對(duì)比淫羊藿主要活性成分的靶蛋白和OC 相關(guān)蛋白作用的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)二者共同作用的通路有363 條，排在前面的是癌癥的分子機(jī)制通路、糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)通路、胰腺癌信號(hào)通路、芳香烴受體信號(hào)通路與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用信號(hào)通路等。共同的分子網(wǎng)絡(luò)有24 個(gè)，主要體現(xiàn)在“癌癥、內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)、機(jī)體損傷及異常、細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，結(jié)締組織發(fā)育與功能，組織發(fā)育、基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育”等生物學(xué)功能上，說(shuō)明淫羊藿活性成分主要作用于癌癥的信號(hào)通路、信號(hào)分子受體通路、炎癥反應(yīng)通路等生物學(xué)途徑，調(diào)節(jié)這些途徑可能對(duì)OC 有一定的治療作用。見(jiàn)圖4。

2.5 淫羊藿主要活性成分作用在OC 信號(hào)通路上靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 淫羊藿主要活性成分與OC 之間有許多共同的信號(hào)通路，它們涉及多種生物學(xué)功能。以進(jìn)一步獲得淫羊藿治療OC 的確切靶點(diǎn)，分析了二者共同的一個(gè)代表性的信號(hào)通路：癌癥的分子機(jī)制。淫羊藿作用的靶蛋白R(shí)AS，JNK，AKT，CASP3，JUN，F(xiàn)OS 和CCND1 多次出現(xiàn)在癌癥的分子機(jī)制信號(hào)通路上。同時(shí)，這些蛋白質(zhì)也出現(xiàn)在其他常見(jiàn)的信號(hào)通路中。因此推測(cè)RAS，JNK，AKT，CASP3，JUN，F(xiàn)OS 和CCND1 可能為淫羊藿作用于OC 的靶點(diǎn)。見(jiàn)圖5。

表2 淫羊藿中主要活性成分靶標(biāo)蛋白

圖2 淫羊藿靶點(diǎn)構(gòu)建的通路（A）和代表性網(wǎng)絡(luò)（B-C）圖

表3 卵巢癌相關(guān)主要基因

3 討論

淫羊藿中搜索到130 種化學(xué)成分，其中DL≥0.18且OB≥30%的共有23 種成分，推測(cè)這些成分可能通過(guò)200 個(gè)靶蛋白作用于與OC 相關(guān)的信號(hào)通路。其中，一些學(xué)者已證實(shí)淫羊藿苷可以抑制人類(lèi)OC 細(xì)胞SKOV3 及多藥耐藥細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力，并上調(diào)Caspase-3 蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［30］。本研究通過(guò)分析比較，發(fā)現(xiàn)二者共同作用的通路有363 條，主要體現(xiàn)的生物學(xué)功能有癌癥、內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)、機(jī)體損傷及異常、細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，結(jié)締組織發(fā)育與功能，組織發(fā)育、基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育等方面。特別指出的是，AKT1，CASP3，JUN，F(xiàn)OS 和CCND1 很可能是淫羊藿治療OC 的治療靶點(diǎn)。與本研究結(jié)果一致的是，淫羊藿抑制Akt/NF-κB 通路和降低TNF-α 誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移與癌細(xì)胞的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［19，25，31］。

圖3 卵巢癌相關(guān)基因構(gòu)建的通路（A）和網(wǎng)絡(luò)（B-C）圖

圖5 淫羊藿作用于卵巢癌在“癌癥的分子機(jī)制”通路上的靶點(diǎn)示意圖

同時(shí)，也有研究顯示［32］，淫羊藿苷ICA 呈劑量依賴(lài)性抑制SKOV3 卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)MMP-2 和MMP-9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，從而發(fā)揮抑制OC 的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。有研究表明［33，34］，淫羊藿苷能夠有效地抑制人SKOV3 OC 細(xì)胞的增殖能力，降低OC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，上調(diào)OC 細(xì)胞中miR-519d 的表達(dá)。陳茹等［35］發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來(lái)抑制人OC CAOV3 細(xì)胞株的增殖。淫羊藿苷抑制OC 細(xì)胞的機(jī)制可能比較復(fù)雜，有多種機(jī)制存在。本研究中的AKT1，CASP3，JUN，F(xiàn)OS和CCND1 作為淫羊藿治療OC 的靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究顯示，淫羊藿治療OC 主要涉及的通路是細(xì)胞發(fā)育、增殖、死亡、組織損傷等，并預(yù)測(cè)AKT1、CASP3、JUN、FOS 和CCND1 可能是淫羊藿治療OC 的潛在靶點(diǎn)。