張 哲 佟凌霞 李朝軍 汪曉春

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，可占到所有甲狀腺癌的85%以上[1]，多發(fā)生于女性，近年來(lái)的發(fā)生率有著明顯的上升趨勢(shì)?，F(xiàn)代研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由多因素、多階段、多步驟共同參與，不僅與細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)失衡相關(guān)，也與原癌基因的激活和抑癌基因的滅活有關(guān)[2-3]。BRAF基因突變是甲狀腺癌最常見(jiàn)也是最有特異性的基因改變，可能決定乳頭狀癌的臨床和病理表現(xiàn)[4-5]。當(dāng)前有研究顯示BRAF V600E基因突變率與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不良預(yù)后關(guān)系密切[6-8]。本文具體探討了甲狀腺癌病理特征與及分子標(biāo)志物BRAF V600E基因的相關(guān)性，希望為從分子水平判斷患者的病情提供參考?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

調(diào)取本院2017年1月至2018年12月年收治的甲狀腺外科手術(shù)治療患者共184例，其中甲狀腺乳頭狀癌患者60例(甲狀腺癌組)，良性甲狀腺腫124例(甲狀腺腫組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究；所有入選者的臨床病歷資料完整；都有明確的病理檢查結(jié)果；年齡在20～80歲之間；入選者納入研究前未接受過(guò)手術(shù)、放療、化療或者激素治療；入選者在自愿條件下簽署了知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠與哺乳期婦女；臨床資料與病理學(xué)資料缺項(xiàng)者；合并其他系統(tǒng)腫瘤病史；合并心、肺、肝、胃等重要臟器的疾病。

甲狀腺腫組：男性40例，女性84例；年齡最小29歲，最大78歲，平均(59.11±2.879)歲，平均體重指數(shù)(22.10±2.19)kg/m2。

甲狀腺癌組：男性18例，女性42例；年齡最小28歲，最大77歲，平均年齡(58.23±4.11)歲，平均體重指數(shù)(22.83±1.23)kg/m2；臨床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例；分化程度：低分化21例、中分化19例、高分化20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例；包膜浸潤(rùn)20例。

2組患者的性別、年齡、體重指數(shù)對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 分子標(biāo)志物檢測(cè)

取所有患者的外周空腹靜脈血1～2 ml，分離全血組織。使用QIAGEN血液基因組DNA抽提試劑盒快速高效分離基因組DNA，利用特異雙擴(kuò)增技術(shù)對(duì)BRAF V600E進(jìn)行PCR檢測(cè)。BRAF V600E正向引物：5’-ATTTGGCCTAGCTCCTAA-3’，反向引物：5’-CGTCTTTACCCAGCAGTGT-3’。PCR過(guò)程：95 ℃10 min酶活化，后續(xù)40 cycles，95 ℃15 s，延伸60 ℃ 1 min，檢測(cè)設(shè)備為ABI 7500熒光定量PCR儀，PCR試劑盒為BRAF V600E突變檢測(cè)試劑盒(上海生工公司)，若樣本信號(hào)Ct≥28，則樣本為陰性；若樣本的信號(hào)Ct值<28，則樣本為陽(yáng)性。

1.3 病理特征調(diào)查

調(diào)查所有患者的良惡性狀況，均經(jīng)2名病理醫(yī)生重復(fù)觀片共同確定病理診斷。記錄甲狀腺癌組患者的病理特征，包括臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜浸潤(rùn)等。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 22.00 for windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差、率等表示，對(duì)比為t檢驗(yàn)與卡方χ2分析，影響因素采用多因素logistic回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BRAF V600E基因突變率對(duì)比

甲狀腺癌組患者的BRAF V600E基因突變率為55.0%(33/60)，顯著高于甲狀腺腫組的6.5%(8/124)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.033，P<0.05)。

2.2 BRAF V600E基因突變率與病理特征的相關(guān)性

在甲狀腺癌組60例患者中，隨著臨床分期增加、分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與包膜浸潤(rùn)，BRAF V600E基因突變率顯著增加，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 甲狀腺癌組患者BRAF V600E基因突變率與病理特征的相關(guān)性(例，%)

2.3 影響因素分析

在甲狀腺癌組60例患者中，以BRAF V600E基因突變率作為因變量，以病理特征為自變量，多因素logistic回歸分析顯示臨床分期(Ⅱ期/Ⅲ期)、分化程度(低分化)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜浸潤(rùn)都為影響患者BRAF V600E基因突變率的因素(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 影響甲狀腺癌組患者BRAF V600E基因突變率的因素分析(n=60)

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是目前最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國(guó)逐漸增加。當(dāng)前甲狀腺癌的病因尚不十分清楚，其中經(jīng)歷了多步驟、多階段、多因素、多基因變異參與的復(fù)雜的生物學(xué)演變過(guò)程，發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜[9-10]。該病病灶組織在顯微鏡下多有纖維瘢痕組織，形態(tài)不規(guī)則，排列擁擠，細(xì)胞核淡染，乳頭中心可見(jiàn)同心圓結(jié)構(gòu)的砂粒體。由于部分患者的病灶形態(tài)特征不明顯，特別是呈濾泡狀排列的病例，需要與甲狀腺腫相鑒別[11-12]。

BRAF V600E屬抑癌基因，可以通過(guò)p53促使細(xì)胞周期抑制因子p21的表達(dá)，還能快速定位并通過(guò)同源重組和非同源末端連接等途徑修復(fù)損傷DNA，阻止受損細(xì)胞進(jìn)入下一周期[13]。BRAF V600E的表觀丟失或表達(dá)位置變化可對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控及抑癌作用減弱，從而能造成甲狀腺癌的發(fā)生[14]。當(dāng)前細(xì)胞學(xué)標(biāo)本或組織病理BRAF V600E基因檢測(cè)突變是診斷甲狀腺乳頭狀癌特異性很高的指標(biāo)之一，此外BRAF V600E基因突變陽(yáng)性的甲狀腺乳頭狀癌較BRAF V600E基因突變陰性的甲狀腺乳頭狀癌更具侵襲性，更易發(fā)生頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究顯示甲狀腺癌組患者的BRAF V600E基因突變率為55.0%，顯著高于甲狀腺腫組的6.5%，表明甲狀腺乳頭狀癌患者多伴隨有BRAF V600E基因突變。也有研究表明BRAF V600E基因突變僅存在于甲狀腺惡性腫瘤，以甲狀腺乳頭狀癌的突變率最高，而在正常甲狀腺組織及甲狀腺良性病變中并不存在[17-18]。

甲狀腺乳頭狀癌的臨床分期、包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等已是判斷甲狀腺癌病情的重要因素[19]。本研究顯示在甲狀腺癌組60例患者中，隨著病理分期增加、分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與包膜浸潤(rùn)，BRAF V600E基因突變率顯著增加，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多因素logistic回歸分析顯示臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜浸潤(rùn)都為影響患者BRAF V600E基因突變率的因素，表明BRAF V600E基因突變率與甲狀腺乳頭狀癌的病理類型顯著相關(guān)。當(dāng)前也有研究顯示BRAF V600E基因突變可導(dǎo)致多種基因表達(dá)紊亂，與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、耐藥性等密切相關(guān)[20]，也可影響并修飾基質(zhì)細(xì)胞，募集腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[21-22]。不過(guò)任何單一的分子標(biāo)志物對(duì)檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌的效果都不能十分滿意，而指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)有助于提高甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷準(zhǔn)確率。同時(shí)由于甲狀腺乳頭狀癌病灶較小，所以在病理取材時(shí)，應(yīng)盡量選擇多個(gè)切面，以免漏診。

總之，甲狀腺乳頭狀癌患者多伴隨有BRAF V600E基因突變，與患者的病理特征顯著相關(guān)，可用于輔助判斷患者的病情。