何璟榮 李近都 黃浩 莫以帥 廖迎陽(yáng) 朱少亮 彭寧福（通訊作者）

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 廣西 南寧 530021）

轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)必須用未發(fā)生核糖核酸（Ribonucleic Acid，簡(jiǎn)稱RNA）降解的組織標(biāo)本，才能保障實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的保真性[1]，肝組織內(nèi)RNA 降解酶含量較其它組織豐富[2]，因此肝癌標(biāo)本體外留置的保鮮期備受關(guān)注。本研究對(duì)不同體外留置時(shí)間的肝癌標(biāo)本分別建立基因文庫(kù)，觀察RNA 的穩(wěn)定性及其測(cè)序質(zhì)量。

1.資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源、采集、分組、RNA 提取和質(zhì)量檢測(cè)

本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審理符合倫理規(guī)范，并取得知情同意后，隨機(jī)選取5 例（男3、女2）肝細(xì)胞癌患者在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行根治性部分肝切除術(shù)后的肝癌組織標(biāo)本，25℃室溫體外留置。按體外留置時(shí)間分為10、20、30、40 和50min，共5 組。采用MQ-Gene1000-96 通量全自動(dòng)核酸提取儀，配套石蠟包埋組織基因組RNA 提取試劑盒提取RNA；UV-1900 紫外分光光度計(jì)和安捷倫UniCel DxI800 全自動(dòng)免疫分析儀行穩(wěn)定性質(zhì)量檢測(cè)；Tru Seq Small RNA Sample Prep Kits 構(gòu)建文庫(kù)；Ion Torrent 基因組測(cè)序儀、Fast QC software檢測(cè)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.2 RNA 質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

參照文獻(xiàn)[3-4]綜合評(píng)價(jià)。（1）雜質(zhì)比率：A260、A280 和A230 分別代表核酸、蛋白質(zhì)和有機(jī)溶劑的含量。A260/A230 比值評(píng)估RNA 標(biāo)本有機(jī)溶劑殘留，比值≥1.5 為RNA 雜質(zhì)比合格。A260A/280 比值評(píng)估RNA 標(biāo)本蛋白質(zhì)污染，比值在1.8 ～2.1 之間為合格。（2）穩(wěn)定性比率：5S、18S 和28S 分別代表120、1900 和4700 個(gè)核苷酸的核糖體（rRNA）含量，28s/18s 比值在1.8 ～2.0 間為RNA 穩(wěn)定比合格。（3）完整性指數(shù)（RIN：RNA Integrity Number）：綜合計(jì)算總RNA 比例18S 和28S 曲線下總面積率、28S 峰度、5S 和18S 曲線下總面積率和標(biāo)記峰的高度4個(gè)參數(shù)，RIN ≥6 為RNA 完整度合格。（4）堿基質(zhì)量：將短序列的每個(gè)堿基標(biāo)注其準(zhǔn)確度的值（Q 值），Q ＜20 為堿基正確率達(dá)99%，錯(cuò)誤率為1.0%，Q ≥20 為堿基質(zhì)量合格。（5）CG 含量：要求樣本序列CG 含量的分布與理論含量的分布一致性相關(guān)≤15%，亦可用CG 含量≥48%評(píng)價(jià)CG 含量合格。（6）短序列匹配率：RNA 質(zhì)量與短序列匹配率相關(guān)。在同一批實(shí)驗(yàn)中，匹配率和單一匹配率明顯低的標(biāo)本，判定為RNA 質(zhì)量不合格。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組資料比較用F 檢驗(yàn)，兩兩比較用Q 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 肝癌標(biāo)本體外不同留置時(shí)間與RNA 純度、穩(wěn)定性及完整性的比較

體外留置50 min 組的A260/A280 比值不如留置≤40min 組（P＜0.01），提示放置時(shí)間在50min 內(nèi)各組標(biāo)本提取RNA 的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量純度仍符合最低要求。留置≥40min 組其A260/A230、28S/18S 和RIN 均不如留置≤30min 組（P＜0.01），提示標(biāo)本放置時(shí)間在30min 內(nèi)，其RNA 的酚類化合物比例和大、小分子RNA 的比例與完整性仍然符合最低要求，放置時(shí)間≥40min的標(biāo)本，其酚類化合物比例、大、小分子RNA 比例及RNA 完整性未達(dá)到最低要求（見表1、圖1）。

表1 肝癌標(biāo)本體外不同留置時(shí)間與RNA 純度、穩(wěn)定性及完整性比較（±s，N=5）

表1 肝癌標(biāo)本體外不同留置時(shí)間與RNA 純度、穩(wěn)定性及完整性比較（±s，N=5）

留置時(shí)間 A260/A280 A260/A230 rRNA（28S/18S） RIN 10 min 2.23±0.08 2.09±0.18 1.95±0.13 9.014 20 min 2.17±0.04 2.20±0.08 1.88±0.09 9.224 30 min 2.12±0.09 1.97±0.06 1.92±0.12 8.454 40 min 1.91±0.07 1.91±0.04 1.67±0.01 7.086 50 min 1.58±0.56 1.72±0.07 1.39±0.10 6.332 10 比20（q,P） 0.058,0.726 0.110,0.092 0.074,0.245 0.210，0.562 10 比30（q,P） 0.110,0.508 0.120,0.068 0.028,0.656 0.560，0.131 10 比40（q,P） 0.320,0.064 0.186,0.007 0.282,0.000 1.928，0.000 10 比50（q,P） 0.656,0.001 0.374,0.000 0.556,0.000 2.682，0.000

圖1 肝癌標(biāo)本不同放置時(shí)間RNA 純度穩(wěn)定性及完整性的檢測(cè)峰圖與電泳膠圖變化情況

2.2 肝癌標(biāo)本體外不同留置時(shí)間與堿基質(zhì)量、CG 含量及短序列匹配率比較

體外留置50min 組的堿基質(zhì)量不如留置≤40min 組（P＜0.05），提示標(biāo)本RNA 的穩(wěn)定性質(zhì)量符合最低要求。留置≥40min 組的堿基CG 含量、短序列匹配率和單一短序列匹配率不如留置≤30min 組（P＜0.01），提示留置≥40min 組RNA 穩(wěn)定性未達(dá)到最低要求（見表2，圖2）。

表2 肝細(xì)胞癌標(biāo)本不同放置時(shí)間與堿基質(zhì)量、CG 含量及映射讀序率的關(guān)系（±s，,N=5）

表2 肝細(xì)胞癌標(biāo)本不同放置時(shí)間與堿基質(zhì)量、CG 含量及映射讀序率的關(guān)系（±s，,N=5）

放置時(shí)間 %≥Q20 CG 含量（%） 映射率（%） 單獨(dú)映射率（%）10 min 99.96±0.02 49.67±0.58 87.20±0.12 85.55±0.04 20 min 99.96±0.02 50.33±0.44 88.36±0.14 83.19±0.03 30 min 99.97±0.02 49.67±1.16 87.75±0.12 81.81±0.01 40 min 99.95±0.01 46.67±0.56 71.58±0.16 75.80±0.02 50 min 99.93±0.01 44.67±1.53 63.39±0.23 68.08±0.15 10 比20（q,P） 0.006，0.578 0.667，0.418 0.012，0.292 0.034，0.262 10 比30（q,P） 0.014，0.202 0.136，0.863 0.006，0.605 0.037，0.089 10 比40（q,P） 0.100，0.358 3.135，0.000 0.156，0.000 0.097，0.001 10 比50（q,P） 0.026，0.024 5.068，0.000 0.238，0.000 0.175，0.000

圖2 肝癌標(biāo)本不同放置時(shí)間測(cè)序讀序堿基Q 值變化情況

3.討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)RNA 樣本的穩(wěn)定要求比較高，因此嚴(yán)格處置標(biāo)本，對(duì)保障RNA 樣本質(zhì)量在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中具有重要意義。RNA穩(wěn)定性包括純度與完整性兩方面。RNA 純度與提取RNA 的試劑、方法及樣品稀釋度有關(guān)。RNA 完整性與其降解相關(guān)，樣品一旦發(fā)生RNA 降解，其相繼的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果將出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差。研究表明標(biāo)本離體后，其RNA 穩(wěn)定性的影響因素較多，如標(biāo)本儲(chǔ)存環(huán)境、細(xì)胞裂解、RNA 分離方法、內(nèi)源核糖核酸酶（RNase）激活、環(huán)境RNase 污染、低濃度RNA 的沉淀、提取后的RNA 儲(chǔ)存、源自富含降解酶的器官樣品等均可影響RNA 穩(wěn)定性[5]。目前，多數(shù)采用核糖體（rRNA）28S 及18S 的吸收峰值來(lái)評(píng)價(jià)RNA 完整性，通常認(rèn)為一旦降解酶發(fā)生作用，每個(gè)基因降解水平均相同，參考基因在完整及降解樣品中的穩(wěn)定性則有差別；同時(shí)，28S 和18S 條帶比率具有一定的組織及細(xì)胞特異性。因此，基因表達(dá)差異的探索中,應(yīng)將樣品與同標(biāo)本來(lái)源的完整對(duì)照樣品比較,盡量避免完整樣品與降解樣品的相互比較[6]。本研究表明，肝癌組織標(biāo)本離體后，在25℃環(huán)境下放置30min內(nèi)處置，提取RNA的穩(wěn)定性尚有質(zhì)量保障；離體40min 后處置，其RNA 已有一定降解。因此，對(duì)于轉(zhuǎn)錄組研究所采用的肝癌標(biāo)本，為保障標(biāo)本RNA 純度及完整性、保障后續(xù)研究質(zhì)量，應(yīng)在離體后30min 內(nèi)用快速凍存等方法處置。