葉玉萍，馬詩玥，廖林，黃健，鄧雪蓮，林發(fā)全*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣西南寧530021；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西桂林541000)

遺傳性球形紅細胞增多癥(hereditary spherocytosis, HS)是一種紅細胞膜蛋白結(jié)構(gòu)異常所致的遺傳性溶血病，其主要臨床表現(xiàn)為貧血、黃疸、脾腫大和膽石癥，血液學(xué)特征為外周血中出現(xiàn)較多小球形紅細胞。 HS的基本發(fā)病機制是由于編碼紅細胞膜蛋白的基因突變導(dǎo)致紅細胞膜結(jié)構(gòu)與功能異常，其主要致病基因包括SPTA1基因、SPTB基因、SLC4A1基因、ANK1基因、EPB42基因，分別編碼α-血影蛋白、β-血影蛋白、帶3蛋白、錨蛋白和4.2蛋白5種紅細胞膜蛋白[1]。α-血影蛋白是一種細胞骨架蛋白，其與β-血影蛋白結(jié)合形成反平行的α-β異二聚體，兩分子α-β異二聚體頭對頭連接形成四聚體，通過與紅細胞內(nèi)肌動蛋白、帶3蛋白、錨蛋白、4.2蛋白等相互作用，維持紅細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和變形能力[2]。

編碼α-血影蛋白的SPTA1基因位于染色體1q22-q23區(qū)，包含52個外顯子。SPTA1基因突變所致的HS約占遺傳性球形紅細胞增多癥病例的5 %，且多數(shù)患者僅在純合或復(fù)合雜合突變時才表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。 近年來，國內(nèi)外有關(guān)SPTA1基因突變引起HS的研究報道較少。本研究對1例HS患者及其父母的SLC4A1、ANK1、SPTA1、SPTB、EPB42基因各外顯子的編碼區(qū)及剪接區(qū)的序列變異情況進行突變分析，并對患兒母親的胎兒進行產(chǎn)前基因檢測，以探討HS分子遺傳學(xué)特征和產(chǎn)前診斷的臨床意義[3-5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒(圖1 Ⅱ1)，女，6歲，貴州籍，因“反復(fù)皮膚黃染6年伴乏力”入院。出生后48 h出現(xiàn)貧血伴黃疸，曾予輸血治療，效果不佳。

入院查體：一般狀態(tài)尚好，心肺未見異常，全身皮膚鞏膜輕度黃染，腹軟，觸診肝大，肋下約2.0 cm；脾大，肋下約4.0 cm，腹部B超提示“脾腫大”，肝、膽、胰回聲未見明顯異常，個人史家族史無特殊。實驗室檢查：紅細胞、血紅蛋白、紅細胞平均體積、紅細胞平均血紅蛋白含量結(jié)果分別為1.85×1012/L、48.10 g/L、77.26 fL、26.06 pg；總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素結(jié)果分別為96.83 μmol/L、14.94 μmol/L、81.89 μmol/L。尿膽紅素(3+)，G-6-PD酶活性正常，G-6-PD和地中海貧血基因分析未見異常，外周血涂片檢查結(jié)果顯示球形紅細胞達45 %。結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果診斷為HS。完善相關(guān)檢查后，行腹腔鏡脾臟切除術(shù)，術(shù)中病理結(jié)果符合HS引起的脾腫大。術(shù)后1個月復(fù)查，患兒血紅蛋白濃度升至131.30 g/L，外周血球形紅細胞比例降至25 %(圖2)。4年后，患兒母親再次妊娠，轉(zhuǎn)診到我院進行HS產(chǎn)前遺傳咨詢。患兒監(jiān)護人及家系成員均簽署知情同意書。

圖1 HS患者家系系譜圖Fig.1 Pedigree chart of HS pedigree

箭頭所示為典型的球形紅細胞

1.2 方法

1.2.1 α-血影蛋白分析

應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測患兒及其父母紅細胞膜蛋白中α-血影蛋白表達水平。參考文獻[6]提出的方法配制SDS-PAGE分離電泳凝膠。80 V 轉(zhuǎn) 120 V 電泳4 h，轉(zhuǎn)膜2 h，5 % 脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，第二天回收一抗，TBST洗膜3次，室溫孵育二抗 1 h，TBST 洗膜后在Fluor ChemM多色熒光和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

1.2.2 基因檢測分析

采集患兒及其父母外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)提取外周血基因組DNA。通過高通量測序檢測患兒外周血樣本提取的基因組DNA中SLC4A1，ANK1，SPTA1，SPTB和EPB42基因各外顯子的編碼區(qū)及剪接區(qū)的序列變異情況?；純耗赣H妊娠21周，在B超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水10 mL，離心后分離細胞，用上述試劑盒提取羊水細胞DNA，應(yīng)用PCR結(jié)合Sanger測序確認突變位點。

1.2.3 突變致病性預(yù)測

使用基因突變致病性預(yù)測軟件PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)和Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/)對突變位點的致病性進行預(yù)測。 如果兩個軟件預(yù)測結(jié)果均顯示為“有害”，則認為該突變可能具有致病性。

2 結(jié)果

2.1 臨床隨訪實驗室檢查結(jié)果

術(shù)后4年，患兒母親再次妊娠，轉(zhuǎn)診到我院進行HS產(chǎn)前遺傳咨詢?；純杭捌涓改傅膶嶒炇覚z查結(jié)果顯示，患兒總膽紅素和直接膽紅素水平超過正常范圍兩倍，其父母的膽紅素水平正常(表1)。

表1 脾切除術(shù)后4年患兒及其父母的實驗室檢查結(jié)果Tab.1 Laboratory test results of the proband and her family in the fourth year after splenectomy

2.2 α-血影蛋白分析結(jié)果

Western blot結(jié)果表明，患兒母親α-血影蛋白表達量與正常人相比未見明顯差異，而HS患兒及其父親的α-血影蛋白表達量下降(圖3)。

1～4分別為患兒父親、患兒母親、患兒和正常對照

2.3 基因檢測結(jié)果

高通量測序結(jié)果顯示患兒HS相關(guān)的5個基因中，SPTA1基因檢測到第16外顯子c.2179_2180delAG(p.Arg727Glufs*27)移碼突變和第26外顯子c.3710A>G(p.Asp1237Gly)錯義突變。PCR結(jié)合Sanger測序法證實了患兒SPTA1基因中這兩個突變位點的存在，并根據(jù)已知位點對其父母SPTA1基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)其父母分別為c.2179_2180delAG(p.Arg727Glufs*27)移碼突變和c.3710A>G(p.Asp1237Gly)錯義突變的雜合子攜帶者[圖4(a)～(d)]，該HS家系SPTA1基因測序分析結(jié)果示于表2。第16外顯子c.2179_2180delAG(p.Arg727Glufs*27)移碼突變，導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔斐砂被峋幋a提前終止[圖4(a)～(b)]。第26外顯子c.3710A>G(p.Asp1237Gly)錯義突變，導(dǎo)致α-血影蛋白中第1237位的天冬氨酸被甘氨酸取代[圖4(c)～(d)]。上述兩個突變均為新突變，在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD; http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)等相關(guān)數(shù)據(jù)庫及醫(yī)學(xué)文獻中未見報道。

(a) 箭頭所示為突變位點：患兒父親第16外顯子c.2179_2180delAG移碼突變 (b) 患兒第16外顯子c.2179_2180delAG移碼突變 (c) 患兒母親第26外顯子c.3710A>G 錯義突變 (d) 患兒第26外顯子c.3710A>G 錯義突變 (e)胎兒羊水細胞SPTA1基因第16外顯子基因測序結(jié)果未檢測到來自父母的SPTA1基因突變 (f) 胎兒羊水細胞SPTA1基因第26外顯子基因測序結(jié)果未檢測到來自父母的SPTA1基因突變

表2 該HS家系中檢測出的SPTA1基因突變Tab.2 SPTA1 gene mutations identified in this pedigree

2.4 突變致病性預(yù)測結(jié)果

運用PolyPhen-2和Mutation Taster對SPTA1基因中兩個新突變的致病性進行預(yù)測，PolyPhen-2軟件預(yù)測c.3710A>G錯義突變?yōu)橹虏⌒酝蛔兊目赡苄孕?，而Mutation Taster軟件預(yù)測結(jié)果則認為該突變可能為致病性突變。 c.2179_2180delAG為移碼突變，可能會造成氨基酸編碼提前終止，產(chǎn)生截短蛋白。PolyPhen-2和Mutation Taster預(yù)測結(jié)果均表明c.2179_2180delAG為致病性突變的可能性大。

2.5 產(chǎn)前診斷結(jié)果

患兒母親羊水細胞DNA基因分析未檢測到來自父母的SPTA1基因突變[圖4(e)～(f)]，胎兒為SPTA1基因c.2179_2180delAG(p.Arg727Glu fs*27)雜合變異導(dǎo)致的HS患者的可能性小。 經(jīng)遺傳咨詢，患兒母親繼續(xù)妊娠并分娩了健康女嬰，其與HS相關(guān)的實驗室檢查結(jié)果均在正常范圍內(nèi)：血紅蛋白122.00 g/L，紅細胞計數(shù)5.19×1012/L，總膽紅素19.41 μmol/L，直接膽紅素5.69 μmol/L。

3 討論

HS的分子發(fā)病機制是基因突變導(dǎo)致紅細胞膜蛋白缺陷，與紅細胞膜脂質(zhì)雙分子層垂直聯(lián)接作用減弱，引起紅細胞膜脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定性降低，膜脂質(zhì)以微囊泡的形式釋放，使紅細胞表面積減少，紅細胞呈球形改變[7-8]。HS患者紅細胞膜結(jié)構(gòu)完整性受損與膜脂質(zhì)結(jié)合的丙酮酸激酶(PK)丟失而引起PK活性降低有關(guān)，可能會加劇溶血的嚴重程度[9]。HS的遺傳方式多為常染色體顯性遺傳，約占HS患者的75 %，另約 25 % 的患者無家族史，可表現(xiàn)為自發(fā)突變或隱性遺傳。α-血影蛋白缺陷引發(fā)的HS為常染色體隱性遺傳，而β-血影蛋白缺陷引發(fā)的HS為常染色體顯性遺傳，因為α-血影蛋白的表達量為β-血影蛋白的4倍，故α-β異二聚體的形成不受α-血影蛋白表達量相對降低的影響。根據(jù)患者血紅蛋白、膽紅素濃度及網(wǎng)織紅細胞計數(shù)，HS可以分為輕度，中度，中重度和重度，許多輕度HS患者臨床癥狀不明顯且缺乏特異性，易被忽視。中重度HS患兒可能表現(xiàn)出精神運動發(fā)育遲緩[10-11]。SEREGINA等[12]研究發(fā)現(xiàn)HS患者并發(fā)血栓的風(fēng)險增加，而血栓彈力圖(TEG)和血栓動力學(xué)分析(TD)有利于監(jiān)測HS患者的凝血系統(tǒng)以預(yù)測血栓形成傾向。

HS在世界范圍內(nèi)均有報道，在北歐人群中，HS是最常見的先天性溶血性貧血，發(fā)病率為1/2 000[13]，同時HS也是日本最常見的先天性溶血性貧血[14]。通過DisMod-II軟件評估中國人1978～2013年HS的患病率，男性為1.27/100 000；女性為1.49/100 000[15]。 然而，中國HS患者中SPTA1基因突變的報道較少。WANG等[16]報道了國內(nèi)1例Coombs實驗陰性的HS患者，發(fā)現(xiàn)SPTA1基因中2個新突變(c.3897-1G> C和c.5029G> A)。SPTA1基因第27-1內(nèi)含子中的c.3897-1G> C突變破壞了共有的剪接位點，為主要致病突變。而c.5029G> A(p.Gly1677Arg)突變則導(dǎo)致α-血影蛋白第1677位的甘氨酸被精氨酸取代。PolyPhen-2，SIFT和MutationTaster軟件預(yù)測結(jié)果均表明，c.3897-1G> C和c.5029G> A可能為致病性突變。

脾切除術(shù)適用于中度至重度HS患兒，但過早切脾會使機體免疫力下降，易引發(fā)嚴重感染，因此原則上應(yīng)在6歲后行脾切除術(shù)，以降低脾切除術(shù)后敗血癥的發(fā)生率[17]。本研究中，術(shù)后第4年復(fù)查，患兒的高膽紅素血癥已得到一定程度的糾正，但網(wǎng)織紅細胞，總膽紅素和直接膽紅素水平仍高于正常范圍，這與MARIANI等[18]先前報道的血影蛋白缺陷HS患者脾切除后的情況相符。

本研究發(fā)現(xiàn)SPTA1基因中的2個新突變，分別為c.2179_2180delAG(p.Arg727Glufs*27)移碼突變和c.3710A>G(p.Asp1237Gly)錯義突變，c.2179_2180delAG(p.Arg727Glufs*27)移碼突變導(dǎo)致突變位點后第27個密碼子存在終止密碼子，SPTA1基因翻譯提前終止，產(chǎn)生截短蛋白，影響α-血影蛋白的功能。PCR結(jié)合Sanger測序法證實了患兒SPTA1基因中這2個突變位點分別來自其父母，并對再次妊娠的患兒母親羊水細胞進行基因分析，對胎兒成功進行了產(chǎn)前診斷。由于HS患者的臨床表現(xiàn)具有明顯的異質(zhì)性，易造成漏診和誤診，因此基因檢測對HS的確診起重要作用。此外，HS的熱點突變較少，絕大多數(shù)報道的突變?yōu)镠S家系所特有的新突變。對HS家系相關(guān)致病基因進行突變檢測，可發(fā)現(xiàn)無癥狀或癥狀輕微的患者及致病基因攜帶者，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。