劉新輝，李鑫，張帥，周秀芝，申玉金，王情情

(山東拜爾檢測(cè)股份有限公司，山東 濰坊，261000)

蛋白質(zhì)常規(guī)測(cè)試方法為凱氏定氮法，即通過測(cè)定含氮量來間接估算蛋白質(zhì)含量，這樣可通過添加含氮量高的化合物來提高蛋白質(zhì)的含量水平。三聚氰胺(melamine)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，含氮量約66%，通過添加三聚氰胺會(huì)提高食品的蛋白質(zhì)測(cè)試含量，而且會(huì)使劣質(zhì)食品通過食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)[1]，因此，單獨(dú)檢測(cè)三聚氰胺是發(fā)現(xiàn)違法添加的關(guān)鍵。GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》規(guī)定了高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法這4種檢測(cè)方法。在高效液相色譜法中需使用離子對(duì)試劑置換色譜柱硅膠上面的鍵合相，以達(dá)到分離的效果。而離子對(duì)試劑會(huì)吸附在色譜柱填料的活性位點(diǎn)上，難以被沖洗下來，導(dǎo)致柱子的死體積增加，出現(xiàn)保留時(shí)間提前，理論塔板數(shù)降低，分離度變差的情況。這個(gè)吸附過程是不可逆的，大大降低了色譜柱的使用壽命[2];氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法需經(jīng)衍生處理，步驟繁瑣，成本高，且前處理用到的乙酸鉛毒性較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的潛在危害較大[3];液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法前處理過程得到的提取液澄清度較差，增加了固相萃取過程的難度，經(jīng)加標(biāo)驗(yàn)證相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差常超出10%的標(biāo)準(zhǔn)要求。

本研究簡(jiǎn)化了前處理過程，適用于大批量樣品的篩查，采用內(nèi)標(biāo)法定量可獲得穩(wěn)定的結(jié)果，Poroshell 120 HILIC色譜柱使用常規(guī)反向溶劑即可獲得良好的保留與分離效果[4]，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)乳及乳制品中三聚氰胺的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、乙酸、乙酸銨均為色譜純，購自德國(guó)CNW公司;三聚氰胺(貨號(hào)：C14861400)購自德國(guó)Dr.Ehrensorfer標(biāo)準(zhǔn)品公司;三聚氰胺-C13內(nèi)標(biāo)(貨號(hào)：OP061)，購自德國(guó)WITEGA標(biāo)準(zhǔn)品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290Ⅱ-6495QQQ(配有電噴霧離子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，購自美國(guó)Agilent公司;AS-E40UVT-R純水儀，購自重慶奧思德儀器設(shè)備有限公司;MULTI REAX渦旋振蕩器，購自德國(guó)Heidolph公司;ME 240E分析天平，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;3K15冷凍離心機(jī)，購自德國(guó)sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司;Dispensette?Organic分液器及移液槍，購自德國(guó)BRAND公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取三聚氰胺及三聚氰胺-C13內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg(精確到0.01 mg)用50%甲醇水溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃下保存待用;吸取1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，以50%甲醇水將其稀釋定容為20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液250 μL于50 mL容量瓶中，以50%甲醇水將其稀釋定容為100 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下避光保存;按同樣方式將內(nèi)標(biāo)稀釋為1 000 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Poroshell 120 HILIC色譜柱(3.0×10 mm，2.7-Micron)。流動(dòng)相:A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈;流速0.45 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量2 μL。采用梯度洗脫程序:0～2 min，90%B;2～3 min，90%～60%B;3～4 min，60%B;4～5 min，60%～30%B;5～6 min，30%B;6～6.5 min，30%～90%B;6.5～8 min，90%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)，溫度設(shè)定為325 ℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行分析，正離子掃描，干燥氣、鞘氣流速均為10 L/min，鞘氣溫度為350 ℃。具體的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 三聚氰胺及三聚氰胺內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)條件Tab.1 The mass spectrometric detection conditions for melamine and internal standard material

1.4.3 樣品前處理

1)稱樣及預(yù)處理。液態(tài)乳及乳飲料:稱取5.00 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL比色管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL。

乳粉:稱取2.00 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL比色管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL。

奶酪、奶油、巧克力、奶糖:稱取2.00 g樣品(精確至0.01 g)于研缽中，加5.00 g海砂充分研磨后[5]，一并轉(zhuǎn)移到50 mL比色管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL。

2)提取。于比色管中加入10 mL 2%乙酸水溶液，渦旋混勻10 min，40 ℃超聲溶解10 min[6]。用乙腈定容至50 mL刻度處，渦旋混勻2 min。靜置5 min后過0.22 μm濾膜后待測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選取

三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)上有三嗪母核，母核上氫被氨基取代，而呈現(xiàn)堿性[7]。其logP只有-1.37(logP指某物質(zhì)在正辛醇和水中的分配系數(shù)比值的對(duì)數(shù)值)，是一個(gè)極性很強(qiáng)的物質(zhì)，微溶于水，可溶于乙酸、乙腈。考慮到ESI+模式的檢測(cè)條件和初步沉淀蛋白質(zhì)的作用，故選用2%乙酸水溶液作為提取溶劑。

2.2 沉淀蛋白方法的確定

常用的沉淀蛋白的方式有酸沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、沉淀劑沉淀法。本研究采用HILIC親水作用色譜，采用強(qiáng)極性固定相，結(jié)合高比例有機(jī)相/低比例水相來達(dá)到保留強(qiáng)極性化合物的目的。考慮到與初始流動(dòng)相與親水作用色譜的兼容性，本研究采用乙腈沉淀蛋白[8-9]。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相、色譜柱、溶劑效應(yīng)、色譜梯度條件及化合物性質(zhì)均會(huì)影響色譜分離及保留，HILIC親水作用色譜適合于logP很小或?yàn)樨?fù)值以及帶有親水、離子或可電離的基團(tuán)的化合物[10]，且高有機(jī)相和低水相的流動(dòng)相組成有利于提高電噴霧離子化質(zhì)譜的效率。本研究采用Agilent Poroshell 120 HILIC色譜柱進(jìn)行分離，該色譜柱結(jié)合了表面多孔顆粒填料和創(chuàng)新型手性固定相，可提高強(qiáng)極性化合物的通量、分離度及保留[11-12]。分別考察了5和10 mmol/L乙酸銨水溶液、5和10 mmol/L甲酸銨水溶液為流動(dòng)相水相的分離效果，最終確定5 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈為最佳流動(dòng)相，在低緩沖鹽濃度下，有利于色譜柱維護(hù)且保留適中、響應(yīng)較高、峰型對(duì)稱。其標(biāo)準(zhǔn)溶液的HILIC-MS/MS總離子流圖如圖1所示，三聚氰胺及三聚氰胺內(nèi)標(biāo)的色譜圖及質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖

圖2 三聚氰胺及三聚氰胺內(nèi)標(biāo)的色譜圖及質(zhì)譜圖

離子源參數(shù)優(yōu)化設(shè)置直接影響分析的靈敏度和穩(wěn)定性，通過優(yōu)化離子源溫度、干燥氣溫度及流量、鞘氣溫度及流量、碎裂電壓、碰撞能量、其他輔助霧化干燥氣等參數(shù)[13]。確定以m/z127/85和127/68為定性離子對(duì)，以m/z127/85為定量離子對(duì)。

采用的安捷倫6495型質(zhì)譜儀具有新型預(yù)四極桿離子傳輸聚焦技術(shù)、彎曲錐形碰撞池以及高能電子倍增管檢測(cè)器設(shè)計(jì)，可以大大提高離子的聚焦傳輸，產(chǎn)生更有效的離子碎片和更高的離子/電子轉(zhuǎn)化率。因本研究前處理未通過固相萃取凈化且未經(jīng)濃縮，6495型質(zhì)譜儀在低進(jìn)樣量下可保證高靈敏度、穩(wěn)定性、抗污染能力及降低基質(zhì)效應(yīng)的影響[14-15]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

取空白試樣按照1.4.3的方法制備空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐級(jí)稀釋，得到0.2，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按從低到高的質(zhì)量濃度依次經(jīng)HILIC-MS/MS測(cè)定[16-17]，以三聚氰胺定量離子對(duì)m/z127/85的峰面積Y對(duì)其質(zhì)量濃度X(Hg/L)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Y=0.013 563*X-0.073 763，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 522 50，線性關(guān)系良好。三聚氰胺的檢出限(以S/N>3計(jì))為0.002 mg/kg，定量限(以S/N>10計(jì))為0.005 mg/kg。不同試樣中所含的三聚氰胺含量水平差異較大，若測(cè)定結(jié)果超出了本方法的線性范圍，需使用初始流動(dòng)相對(duì)樣品溶液稀釋后再測(cè)定。

2.5 精密度、回收率和準(zhǔn)確性

將同一份液體乳、乳粉樣品分成2份，其中一份作本底，另一份添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液后按照本文建立的方法進(jìn)行處理和測(cè)定，每份樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，考察方法的回收率和精密度[18]。該方法的回收率為94.2%～104.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.25%～5.47%，可見方法的回收率高，重現(xiàn)性好;按此方法對(duì)編號(hào)為CFAPA-QC025A-1的質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)控樣指定值為0.63 mg/kg，實(shí)際測(cè)定值為0.59 mg/kg，按“Z-比分?jǐn)?shù)”的方式評(píng)價(jià)，|Z|=0.22。當(dāng)|Z|≤2時(shí)，測(cè)試結(jié)果滿意，可見該方法的準(zhǔn)確性高。

2.6 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較

與GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》相比定量限更低，標(biāo)準(zhǔn)定量限為0.01 mg/kg、本研究定量限為0.005 mg/kg;無需固相萃取凈化，節(jié)省成本;無濃縮過程，較低的基質(zhì)干擾在一定程度上更有利于提高化合物的離子化;內(nèi)標(biāo)定量，可校正基質(zhì)效應(yīng)且重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

本研究建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定乳及乳制品中三聚氰胺的分析方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，精密度高，定性定量準(zhǔn)確，適合各類乳制品中三聚氰胺的準(zhǔn)確定性定量，是乳及乳制品中三聚氰胺本底含量水平調(diào)研的有效方法，也可為嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控提供有力的技術(shù)支持。