蘇 曦， 周 琰， 沈敏娜， 李懿皞， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）是一種感染性疾病的常見病原體，與傳染性單核細(xì)胞增多癥、鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等密切相關(guān)[1]。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EBV DNA的樣本類型主要為血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。有研究結(jié)果顯示，不同樣本類型之間EBV DNA檢測(cè)結(jié)果會(huì)有差異[2]。為此，本研究擬通過比較不同疾病患者不同樣本類型之間EBV DNA檢測(cè)結(jié)果的差異，為不同疾病患者樣本的選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1—12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院進(jìn)行EBV DNA檢測(cè)的患者2 694例，其中男1 639例、女1 055例，年齡12～90歲；確診鼻咽癌84例、霍奇金淋巴瘤119例、非霍奇金淋巴瘤466例。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理 采集所有對(duì)象靜脈血6 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用梯度密度離心法提取PBMC，F(xiàn)icoll分離液購(gòu)自瑞典GE Healthcare公司，棄上清，留沉淀備用。將剩余血樣950×g離心10 min，分離血漿，吸取100 μL血漿至Eppendorf管中，與等量DNA濃縮液充分混勻，17 950×g離心10 min，棄上清，留沉淀備用。PBMC及血漿EBV DNA提?。合蚝蠵BMC及血漿沉淀的Eppendorf管中各加入核酸裂解液50 μL，充分混勻后100 ℃孵育10 min，15 300×g離心5 min后備用。

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） EBV DNA熒光定量PCR試劑購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，檢測(cè)儀器為L(zhǎng)ightCycler 480 PCR擴(kuò)增儀（瑞士羅氏公司）。反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)液40 μL、Tap酶3 μL，模版2 μL。擴(kuò)增條件：93 ℃ 2 min；93 ℃ 20 s，57 ℃45 s，共40個(gè)循環(huán)；40 ℃ 10 s。每次檢測(cè)均設(shè)陰性和陽(yáng)性質(zhì)控，分別以陽(yáng)性定量參考品104、105、106、107拷貝/mL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)分析與回歸分析。結(jié)果判定：檢測(cè)到核酸擴(kuò)增且增長(zhǎng)曲線呈S型判定為檢出EBV DNA（陽(yáng)性），無(wú)擴(kuò)增曲線判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將EBV DNA拷貝數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。2種樣本之間的一致性比較采用Kappa一致性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC和血漿EBV DNA的檢測(cè)結(jié)果

2 694例樣本中，PBMC EBV DNA和血漿EBV DNA均陽(yáng)性的樣本為131例（4.86%），血漿EBV DNA陰性而PBMC EBV DNA陽(yáng)性的樣本為1 045例（38.79%），血漿EBV DNA陽(yáng)性而PBMC EBV DNA陰性的樣本為3例（0.11%），血漿EBV DNA和PBMC EBV DNA均陰性的樣本為1 515例（56.24%）。一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2種樣本檢測(cè)結(jié)果的一致性較低（Kappa＜0.4）。

在血漿和PBMC雙陽(yáng)性的131例樣本中，PBMC EBV DNA拷貝數(shù)高于血漿EBV DNA拷貝數(shù)（Kappa=0.122，P＜0.001）。見圖1。

圖1 PBMC與血漿EBV DNA拷貝數(shù)的比較

2.2 鼻咽癌患者PBMC和血漿EBV DNA檢測(cè)結(jié)果的比較

84例鼻咽癌患者中有24例（28.57%）PBMC EBV DNA陽(yáng)性，血漿EBV DNA均為陰性。PBMC EBV DNA拷貝數(shù)明顯高于血漿EBV DNA拷貝數(shù)（kappa=0.444，P＜0.001）。見圖2。

2.3 霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血漿EBV DNA檢測(cè)結(jié)果的比較

1 1 9例霍奇金淋巴瘤患者中有4 5例（37.82%）PBMC EBV DNA陽(yáng)性，有6例（5.04%）PBMC和血漿EBV DNA均陽(yáng)性，有39例（32.77%）血漿EBV DNA陰性而PBMC EBV DNA陽(yáng)性，有74例（62.18%）PBMC和血漿EBV DNA均陰性。PBMC EBV DNA拷貝數(shù)高于血漿EBV DNA拷貝數(shù)（Kappa=0.161，P＜0.001）。見圖3。

圖2 鼻咽癌患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數(shù)的比較

圖3 霍奇金淋巴瘤患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數(shù)的比較

2.4 非霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血漿EBV DNA檢測(cè)結(jié)果的比較

4 6 6例非霍奇金淋巴瘤患者有1 9 3例（41.42%）PBMC EBV DNA陽(yáng)性，有24例（5.15%）PBMC和血漿EBV DNA均陽(yáng)性，有169例（36.27%）血漿EBV DNA陰性而PBMC EBV DNA陽(yáng)性，有273例（58.58%）PBMC和血漿EBV DNA均陰性。PBMC EBV DNA拷貝數(shù)明顯高于血漿EBV DNA拷貝數(shù)（Kappa=0.143，P＜0.001）。見圖4。

圖4 非霍奇金淋巴瘤患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數(shù)的比較

3 討論

目前，檢測(cè)EBV的方法主要為病毒的分離和鑒定、病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)方法等。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，分子診斷成為EBV檢測(cè)的主要方法。與其他檢測(cè)技術(shù)相比，PCR具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療及療效監(jiān)測(cè)。檢測(cè)EBV DNA的樣本主要為PBMC和血漿，但提取PBMC步驟繁瑣，手工操作較多，易影響檢測(cè)結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，PBMC EBV DNA和血漿EBV DNA檢測(cè)結(jié)果的一致性差（Kappa＜0.4）。外周血中的EBV DNA一般是以溶解的線型DNA或環(huán)狀DNA形式游離存在，血漿中的EBV載量遠(yuǎn)低于PBMC。因此，不建議以血漿完全替代PBMC進(jìn)行EBV DNA檢測(cè)。

EBV DNA陽(yáng)性是EBV存在的直接證據(jù)。EBV在感染細(xì)胞內(nèi)主要有2種存在形式：增殖性感染和潛伏性感染[3]。由于存在潛伏感染，因此在正常人PBMC中也可能有低拷貝的EBV DNA被檢出，但通常低于實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性報(bào)告范圍。EBV感染人體后便進(jìn)入增殖期，病毒在淋巴細(xì)胞中大量增殖并釋放入血漿或淋巴液中，此時(shí)在患者PBMC或血漿中可檢測(cè)到高拷貝的EBV DNA。因此PBMC中的EBV DNA拷貝數(shù)一般遠(yuǎn)高于血漿。在病毒潛伏階段，對(duì)PBMC中的EBV DNA進(jìn)行檢測(cè)，可對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷或進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)。而在病毒增殖階段，EBV在PBMC中大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞破裂、溶解，病毒大量釋放入血，此時(shí)檢測(cè)血漿中的EBV DNA價(jià)值更大。

另外，本研究還回顧分析了患者的病史資料，比較了鼻咽癌患者、霍奇金淋巴瘤患者和非霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血漿樣本中EBV DNA的陽(yáng)性率。結(jié)果顯示，不同疾病患者PBMC與血漿樣本中EBV DNA的陽(yáng)性率和拷貝數(shù)均有差異。

有學(xué)者認(rèn)為鼻咽癌患者首推的樣本類型是血漿[4]。還有學(xué)者認(rèn)為鼻咽癌患者血漿和PBMC的EBV DNA檢測(cè)結(jié)果有很好的一致性[5]。本研究結(jié)果顯示，在24例EBV DNA陽(yáng)性的鼻咽癌患者中，PBMC EBV DNA陽(yáng)性率及拷貝數(shù)均高于血漿（P＜0.001）。原因可能與本研究的鼻咽癌患者絕大部分處于放療治療中或治療后有關(guān)。FAN等[6]發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌緩解期患者的血漿中很難檢測(cè)到EBV DNA，鼻咽癌患者血漿中的EBV DNA拷貝數(shù)可能與疾病進(jìn)程及治療程度有關(guān)。本研究未按疾病進(jìn)程對(duì)鼻咽癌患者再進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，這可能是血漿EBV DNA陽(yáng)性率及拷貝數(shù)低于PBMC的原因。

本研究結(jié)果顯示，在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中，PBMC EBV DNA陽(yáng)性率及拷貝數(shù)均高于血漿（P＜0.001），這與朱耀武等[7]的研究結(jié)果一致，但陽(yáng)性率低于陸海英等[8]的報(bào)道。由此可見，對(duì)于EBV感染患者，檢測(cè)PBMC EBV DNA的敏感性高于血漿，可用于臨床治療后的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。本研究EBV DNA陽(yáng)性率低于文獻(xiàn)報(bào)道[8]，可能與本研究入組的淋巴瘤患者，未按疾病治療進(jìn)程進(jìn)行分組有關(guān)。對(duì)于需進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的患者，可以通過設(shè)定臨界值來判斷病毒感染處于潛伏期還是活動(dòng)期。

綜上所述，由于PBMC EBV DNA陽(yáng)性率和拷貝數(shù)均高于血漿，且EBV DNA拷貝數(shù)與患者是否需接受治療密切相關(guān)。因此，對(duì)于EBV感染的診斷和監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)與臨床溝通，結(jié)合疾病類型選用合適的樣本類型。