賀 倩，劉 翠，李新欣，周 霞

（西南交通大學 生命科與工程學院，四川 成都 610031）

消化酶是將食物消化分解為利于人體吸收的小分子物質[1]，即存在于人體消化道中，又是許多藥物的重要組成成分，本質上是一種蛋白質，故具有蛋白質的各種性質，如其生理活性受溫度、pH值等環(huán)境因素的影響；而存在于藥物中的消化酶活性還與加工過程，如炮制時間、炮制方法等密切相關。

麥芽性甘、味平，為禾本科植物大麥HordeumvulgareL.的成熟果實經發(fā)芽干燥的炮制加工品[2]，臨床常用的消食藥之一。酶類、糖類為麥芽主要活性成分，具有活血化瘀、行水消腫等藥理作用[3]，然而目前對于麥芽功效研究絕大部分聚焦于消食方面。因此，本研究選取蛋白酶及淀粉酶為指標，旨在通過測定麥芽炒制過程，不同時間淀粉酶與蛋白酶活力的變化規(guī)律，為麥芽炒制消食的機理研究提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

麥芽飲片（安徽181110北京同仁堂四川有限責任公司）；麥芽糖對照品（純度≥98%貴州迪大生物科技有限公司）；酪蛋白（AR成都科龍化工試劑有限公司）；福林試液（AR上海荔達生物科技有限公司）；酪氨酸對照品（純度≥99.0%上?；叟d生化試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

PWC-124電子分析天平（艾德姆衡器（武漢）有限公司，max=120g，d=0.0001g）；GM900 非接觸式紅外測溫槍（深圳市聚茂源科技有限公司）；LX-02利祥多功能粉碎機（上海江信科技有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；SB-25-12D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9030A電熱恒溫恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；752N紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

炒鍋預熱，依《中國藥典》2015版四部清炒法（通則 0213），于 380～450℃[4]清炒麥芽，從 0 開始，依次間隔2min取樣，共7次，編號M0-M6，冷卻后粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 淀粉酶活力測定[5]

1.2.2.1 淀粉酶提取液的制備 于各研缽中稱取編號M0-M6的麥芽樣品1g，加入10mL蒸餾水，研磨均勻后轉移至離心管，于25℃下靜置20min，間隔數分鐘振搖1次，再以5000r·min-1條件離心30min后，收集上清液，轉至編號為MT0-MT6的25mL量瓶，加蒸餾水定容，搖勻，即得。

1.2.2.2 DNS試劑的配制 于盛有25mL蒸餾水的燒杯中溶解酒石酸鉀鈉9.1g，水浴至微熱后逐次加入3,5-二硝基水楊酸0.32g、NaOH 1.0g、苯酚0.25g，攪拌至全，轉至50mL棕色容量瓶中，冷卻后定容，于室溫暗處保存。

1.2.2.3 淀粉溶液的配制 稱取可溶性淀粉1.0g，加至盛有50mL蒸餾水的燒杯中加熱至完全溶解，待冷卻后轉入容量瓶，用蒸餾水定容至100mL，室溫保存。

1.2.2.4 繪制標準曲線 稱取0.1g麥芽糖對照品溶于100mL蒸餾水中，配制得1mg·mL-1麥芽糖對照液。取20mL具塞刻度試管7支并編號1～7，于試管中加入麥芽糖對照液 0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL，配置成具有濃度梯度的溶液，混勻。將2mL DNS試劑加入各試管中，并以水浴加熱至沸騰5min，冷卻后定容至15mL?？瞻讓φ諡?號試管，在波長540nm處，以比色管測吸光度，將麥芽糖濃度和吸光度進行線性分析，得回歸方程A=10.727C-0.0122，r=0.9996，且麥芽糖濃度在 0.025～0.122 mg·mL-1內與吸光度線性相關。

1.2.2.5 樣品淀粉酶活力的測定 7支20mL具塞玻璃試管中各加入淀粉酶提取液1mL，并編號MC0-MC6。將各試管和“2.2.3”項下配制的淀粉溶液于40℃水浴10min，并加入1mL淀粉溶液于各試管中于40℃水浴5min，取出后，將2mL DNS試劑加入其中，混勻后煮至沸騰5min，冷卻后以蒸餾水定容，即得。另取7支試管作空白對照，編號KF0-KF6，將1mL淀粉溶液換成蒸餾水，其余操作同上,于540nm波長處檢測，共3次。取樣品3次吸光度平均值，計算出與相應空白對照的吸光度之差，麥芽糖含量可在前述的標準曲線上求得，淀粉酶活性以單位重量麥芽樣品每分鐘在酶催化下產生的麥芽糖的質量表示，即 mg·（min·g）-1。

1.2.2.6 精密度試驗 取0.054mg·mL-1的麥芽糖溶液為標準液，多次測定并記錄吸光度，計算其RSD值為0.147%（n=6），說明該儀器精密度較好。

1.2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取編號M0麥芽樣品1.00g于20mL試管中，按“1.2.2.5”項下依法進行顯色處理，在放置 0、1、2、3、4h 后測其吸光度，結果表明，其在4h內穩(wěn)定，RSD值為1.05%（n=5），樣品穩(wěn)定性高。

1.2.2.8 重復性試驗 以“1.2.2.5”的操作方法，對編號M0的1.00g樣品進行顯色處理，測吸光度并計算。結果得出RDS=0.75%（n=6），表示此實驗具有高重復性。

1.2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取6份未經炮制的麥芽樣品0.5g，將7.50mg麥芽糖對照品加入其中，其余過程同“1.2.2.5”，測吸光度，并將其代入標準曲線計算含量。計算出平均加樣回收率為98.67%，RSD=0.98%，結果證明該實驗方案的準確度良好。

1.2.3 蛋白酶活力測定[6,7]

1.2.3.1 蛋白酶提取液制備 分別稱取編號M0～M6麥芽1g，加20mL蒸餾水，于40℃水浴加熱1h，間斷攪拌，濾過，以PBS緩沖液將濾液稀釋1倍，即得蛋白酶提取液，編號MX0～MX6用于測定蛋白酶活性。

1.2.3.2 磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）的配制 將118mL 0.2mol·L-1NaOH，250mL 0.2mol·L-1KH2PO4溶液與燒杯中攪拌均勻，再轉移至1000mL容量瓶，以蒸餾水稀釋定容，即得。

1.2.3.3 福林酚試液的配制 將等體積4%Na2CO3溶液與0.2mol·L-1NaOH溶液混勻得福林酚試液 A（即甲液）；乙液是將等體積0.04mol·L-1CuSO4溶液與2%酒石酸鈉溶液混勻，甲液∶乙液為50∶1，用時混合均勻，現配現用。

1.2.3.4 三氯醋酸溶液的配制 取6.5g三氯醋酸于燒杯中用少量蒸餾水溶解，后轉移至100mL容量瓶，定容即得。

1.2.3.5 繪制標準曲線 稱取干燥的酪氨酸0.1g于1000mL容量瓶中，加入少量鹽酸使其完全溶解，以蒸餾水定容，配得0.1g·L-1酪氨酸溶液。于6只10mL容量瓶中各加入 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 酪氨酸溶液，加蒸餾水至刻度。另取具塞玻璃試管6支，編 號 T1～T6， 分 別 加 入 濃 度 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg·mL-1酪氨酸溶液 1mL，再將 0.4mol·L-1Na2CO35mL，福林酚試液1mL，蒸餾水2mL加入其中，振搖均勻，于40℃水浴20min。于680nm波長處測定。以酪氨酸濃度和吸光度進行線性回歸，得回歸方程：A=0.0685C+0.0103，r=0.9997, 線性范圍2.156～10.886μg·mL-1。

1.2.3.6 樣品蛋白酶活力的測定 離心管中加“1.2.3.1”項下配制的蛋白酶提取液1mL，將其同酪蛋白一起水浴加熱5min后，于離心管加入1mL酪蛋白，保溫 10min，以加入 2mL 0.4mol·L-1三氯醋酸來終止反應。于40℃水浴保溫持續(xù)20min后離心，將剩余蛋白質過濾后得濾液，于試管依次添加1mL濾液，2mL 蒸餾水，1mL 福林試液，5mL 0.4mol·L-1Na2CO3，搖勻，40℃水浴加熱20min。另取1只離心管作為空白對照，編號L0，取1mL蒸餾水加至離心管，依次加入三氯醋酸2mL和酪蛋白，其余同前。按“1.2.3.5”項下方法，于680nm波長處測定3次。以樣品吸光度平均值與L0號離心管的吸光度做差，計算出的結果代入“1.2.3.5”項下求得的標準曲線，從而計算出酪氨酸質量。蛋白酶活力為40℃時，單位質量麥芽樣品在酶的作用下于單位時間內產生的酪氨酸含量，即 μg·（min·g）-1。

1.2.3.7 精密度試驗 取6份濃度為5.229μg·mL-1的酪氨酸溶液為對照品，測定其吸光度并記錄，求得RSD值為0.285%，可見實驗儀器精密度符合要求。

1.2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取編號M5的麥芽樣品1.00g，顯色過程同“2.3.6”，于4h內每隔1h測定5次吸光度，代入前述求得的標準曲線進行計算，得RSD=0.81%，顯示樣品穩(wěn)定性達標。

1.2.3.9 重復性試驗 取6份炮制8min的麥芽樣品（每份1.00g），每份樣品皆由“1.2.3.6”項下的操作方法顯色，在680nm處測吸光度。以標準曲線計算并求出RDS為1.08%，表明重復性良好。

1.2.3.10 加樣回收試驗 精密稱取6份編號M5的樣品（每份0.5g），于試管中加入2.00g酪氨酸對照品，按“2.3.7”項的實驗方法進行顯色操作，在最佳波長處測吸光度，根據標準曲線算含量。求得其平均回收率為98.12%，（RSD=1.02%），表示本實驗方案的準確度符合要求。

2 結果與分析

2.1 淀粉酶活力的變化

采用DNS比色法測定淀粉酶活力，并規(guī)定在40℃下每分鐘淀粉酶催化分解淀粉生成1mg麥芽糖的酶量為一個活力單位（U），即 U=C×20mL×N/5min=C×100（式中N為稀釋倍數，N=25）。以炒制時間和淀粉酶活力為坐標軸作圖。見表1，圖1。

表1 麥芽淀粉酶活力（n=3）Tab.1 Amylase activity of malt（n=3）

圖1 麥芽淀粉酶活力Fig.1 Amylase activity of malt

結果顯示，麥芽炒制過程中，淀粉酶活力變化趨勢為，先小幅上升后大幅下降。其中，在炒制2min時其增加達到峰值，之后持續(xù)下降，6min時的活力降到生麥芽以下，并在8～12min趨于平緩。0～2min出現上升可能是因為加熱時間短，麥芽內部溫度輕微上升，使淀粉酶活力上升；2min之后大幅度下降是因為隨著炒制時間的延長，麥芽內部溫度增幅變大，淀粉酶開始失活。

2.2 蛋白酶活力的變化

蛋白酶活力的測定采用福林酚試劑法，根據規(guī)定，酶活力單位（U）是40℃下，酪蛋白在蛋白酶催化下每分鐘分解為單位酪氨酸的酶量。即U=C×9mL×160/10min=C×144。以炒制時間和蛋白酶活力為坐標軸作圖。見表2，圖2。

表2 麥芽蛋白酶活力Tab.2 Protease activity of malt

圖2 麥芽蛋白酶活力Fig.2 Protease activity of malt

圖2 表明，麥芽炒制過程中，同淀粉酶活力一樣，蛋白酶活力呈現出與其類似趨勢，即先上升后下降，且幅度較之更小。其中，達峰值時間為2min，活力降至生麥芽以下為4min時。0～2min出現上升可能是因為加熱時間短，麥芽內部溫度輕微上升，使蛋白酶活力上升；2min之后大幅度下降是因為隨著炒制時間的延長，麥芽內部溫度增幅變大，蛋白酶開始失活。

實驗結果顯示，隨炮制時間延長，淀粉酶與蛋白酶活力均降至生麥芽之下，而臨床用作消食主要以焦麥芽，炒麥芽為主。表明麥芽中除了淀粉酶與蛋白酶，可能還有其他有助于消食和胃的成分，其炒制后消食作用機理需待進一步研究。

3 討論

3.1 評價指標的選擇

麥芽主治消化不良，脾虛食少等癥[2]，朱建龍[8]研究發(fā)現不同麥芽炮制品對消化酶，消化液的分泌有不同程度的促進作用。麥芽中與消食相關的成分包括淀粉酶、蛋白酶、轉化糖酶及乳酸等，而上述成分中，蛋白酶和淀粉酶能分別水解蛋白質和淀粉，與人體食物消化吸收最為密切。因此，淀粉酶與蛋白酶活力為本實驗的評價指標，研究麥芽中該兩種消化酶在不同炒制時間下的影響。

3.2 美拉德反應

美拉德反應是一種非酶褐變反應，5-羥基糠醛為其標志中間性產物，在中藥炮制過程中，可通過還原糖與氨基化合物縮聚而成[9]。麥芽糖為含有游離醛基的二糖，是典型的還原糖；而麥芽中存在的消化酶、蛋白質、氨基酸等均含有大量游離氨基，可作為氨基供體與麥芽糖反應。研究顯示[6,10]，麥芽在炒制過程中5-HMF的含量逐漸增加，表明麥芽炮制過程中確實存在美拉德反應，并能產生焦香，健脾消化。故推測麥芽炮制后消食導滯作用增強可能與美拉德反應中產生的一些中間性產物作用有關。

3.3 腸道菌群

腸道菌群為人體腸道內寄居的所有微生物，種類繁多，其能通過分泌腸道酶參與食物中蛋白質、纖維素等物質的代謝，對于體內食物消化吸收發(fā)揮重要作用。腸道菌群失調則引起體內食物分解受阻，導致消化不良。腸道菌群的生長需要益生菌作為底物，鄭紅斌等[11,12]研究發(fā)現麥芽中麥芽纖維是益生菌的一種，可以改善潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群失調狀態(tài)。Araki Y[13]等人實驗表明麥芽纖維中物質能改善腸道環(huán)境，對于胃腸道疾病有良好的治療作用。因此，推測麥芽纖維可以直接促進腸胃蠕動或者通過調控腸道菌群來起到消化積食之功效。