孟祥河 楊奇波 肖 丹 夏朝盛 樊律廷宋麗麗 吳家勝

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，杭州 310014) (浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，杭州 311300)

香榧，作為名貴干堅(jiān)果有著上千年的食用歷史，是國家衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食兩用的食物之一，具有很高的藥用和食用價值[1-2]。香榧籽仁含油量較高，為40.39%～52.80%，其中不飽和脂肪酸約占總脂肪酸的87%，主要為油酸、亞油酸，以及特殊結(jié)構(gòu)的5-亞甲基間隔不飽和脂肪酸——金松酸(5,11,14-20∶3; SCA)[3-4]。

SCA主要分布在裸子植物種子中，是榧籽油的特征性脂肪酸[5-6]。研究表明，金松酸具有控制血脂、抗炎等諸多生理功效[7-11]。目前關(guān)于金松酸的研究主要集中在生理活性方面，由于金松酸來源少、含量低，不易獲得高含量的產(chǎn)品，因此關(guān)于SCA的利用研究鮮有報道。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)通過調(diào)整甘油碳骨架上功能性脂肪酸的種類及位置，實(shí)現(xiàn)特定的理化性質(zhì)與生理活性。典型的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，甘油二酯有1,2-DAG和1,3-DAG兩種異構(gòu)體，少量地存在于天然油脂中[12-13]。1,3-DAG由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，在體內(nèi)難以再合成TAG，因而有防止肥胖、降低餐后血脂含量、防治高血脂、高血壓、心腦血管病等生理活性和功能[14-17]。如果結(jié)合SCA特殊的生理活性合成富含SCA的1,3-DAG可以兼?zhèn)涠ヅc脂肪酸本身的生理功能，對開發(fā)新型的功能性脂質(zhì)、改善人體健康將具有重要而積極的意義[18]。DAG的制備方法主要有直接酯化法、甘油解法和部分水/醇解法。甘油解法和部分水解法都是從油脂直接出發(fā)，特定脂肪酸富集選擇性不高。榧籽油中的SCA起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.45%～14.28%，要制備富含SCA的1,3-DAG，預(yù)純化SCA是必要的。

本研究以榧籽油為原料，制備穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)低、易分離的榧籽油混合脂肪酸乙酯(FAEE)，同時采用尿素包合法富集FAEE的SCA乙酯。通過高1,3-位選擇性的脂肪酶催化高濃度的SCA乙酯與甘油反應(yīng)生物合成富含SCA的1,3-DAG，并對產(chǎn)物脂肪酸的組成進(jìn)行表征，初步實(shí)現(xiàn)了榧籽油功能性SCA的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷、30～60 ℃石油醚、37%濃鹽酸、甘油、乙醇鈉、200～300目硅膠、HPLC級正己烷、異丙醇、甲酸、0.4～0.5 mm硅膠板；亞油酸乙酯、甘油酯：標(biāo)準(zhǔn)品。

Agilent 7890A氣相色譜儀，Waters1525液相色譜儀，Waters 2414示差檢測器，Agilent Poroshell-120液相色譜柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 榧籽油制備

榧籽剝殼，粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后過40目篩子后以1∶4的料液比向榧籽粉末中加入正己烷，在超聲中對榧籽粉末進(jìn)行20 min的兩次浸提，浸提液真空抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得榧籽油。

1.2.2 榧籽油的脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯制備參照GB/T 17376—2008標(biāo)準(zhǔn)方法[19]。取0.1～0.2 g榧子油于50 mL燒瓶中，加入2粒沸石，再加入4 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇，于75 ℃下水浴回流15 min后加入55%的三氟化硼甲醇絡(luò)合物5 mL，繼續(xù)回流2 min，加入2 mL色譜純正己烷，1 min后加入15 mL飽和氯化鈉溶液振蕩15 s，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加入足夠飽和氯化鈉至容量瓶分層，加5 mL色譜純正己烷萃取FAME。取正己烷相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，適當(dāng)稀釋，GC分析。

氣相色譜法(GC)條件：sp-2340色譜柱(60 m×0.25 mm×0.2 μm)，載氣為高純N2，流速20 mL/s，進(jìn)樣口溫度230 ℃，F(xiàn)ID溫度220 ℃，分流比100∶1；進(jìn)樣量1 μL；185 ℃恒溫40 min。

1.2.3 醇解制備榧籽油混合乙酯

取一定量的香榧油溶解于過量無水乙醇中，加入過量的乙醇鈉，55 ℃下磁力攪拌一定時間后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置分層。取上相乙酯層，加入占上相體積20%的60 ℃的蒸餾水洗滌3次，最后加入5% 的HCl溶液洗滌以去除乙酯中殘留的堿與皂[20]。

1.2.4 脂肪酸乙酯的含量測定

準(zhǔn)確稱取約100 mg的醇解產(chǎn)物混合物，添加4 mg的十九酸甲酯，用石油醚∶乙醚=95∶5作為展開劑進(jìn)行TLC層析，刮下乙酯條帶用正己烷溶解后進(jìn)行GC分析。脂肪酸乙酯總量用下式計(jì)算:

式中：M總為總FAEE質(zhì)量，mg；MC19為十九酸添加量，mg；AC19為十九酸甲酯的氣相峰面積；A總為所有脂肪酸酯的峰面積之和。

1.2.5 HPLC法分析反應(yīng)產(chǎn)物甘油酯組成

取約150 mg的反應(yīng)產(chǎn)物，用流動相定容到10 mL容量瓶備用。HPLC法，檢測條件如下： Waters 2410示差折光檢測器，流動相為含0.1%的甲酸的正己烷/異丙醇(20∶1)混合溶液，流速1 mL/min，柱箱溫度35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。各組分通過對比1,3-二油酸甘油酯，1,2-二油酸甘油酯以及TLC分離得到的純品的保留時間確定，含量用峰面積歸一化法計(jì)算。其中TAG、1,3-DAG、1,2-DAG和MAG純品通過TLC法得到：取反應(yīng)后產(chǎn)物用正己烷-乙醚-甲酸(70:30:1)在制備硅膠板上分離，以碘顯色，各條帶刮下后TAG以正己烷萃取，1,3-DAG、1,2-DAG和MAG以乙醚萃取，分別保存。

1.2.6 尿素包合法富集金松酸乙酯

取尿素溶解于95%乙醇中至濃度40%，在70 ℃下磁力攪拌回流直至尿素完全溶解。分別按5∶1～1∶1酯脲比添加混合FAEE，連續(xù)回流2 h，混合物在25 ℃的自來水中冷卻30 min，然后4 ℃靜置12 h。結(jié)晶后的尿素-脂肪酸乙酯混合物趁冷迅速過濾，并用尿素飽和的95%乙醇溶液洗滌濾渣，收集濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入20%體積分?jǐn)?shù)的5% HCl溶液，再加入等體積的正己烷進(jìn)行萃取。下層水相如上重復(fù)萃取2次，合并正己烷萃取相，用20%的蒸餾水洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)正己烷相得到富集SCA的乙酯，稱重。取約50 mg的包合后乙酯，溶于10 mL色譜級正己烷，微濾后GC分析，計(jì)算金松酸乙酯及回收率。

式中：P1為包合后金松酸純度；m1為包合后乙酯質(zhì)量；P0為初始榧籽油金松酸含；m0為包合前乙酯質(zhì)量。

1.2.7 酶促酯交換反應(yīng)合成1,3-DAG的研究

甘油的吸附：將硅膠與甘油1∶1混合，攪拌直至甘油被硅膠完全吸附，形成“干燥”粉末。

酯交換反應(yīng)：按FAEE、甘油摩爾比 2∶1稱取SCA乙酯混合物、硅膠吸附的甘油，磁力攪拌混合，水浴加熱至既定溫度，加入乙酯質(zhì)量5%的固定化酶開始酯交換反應(yīng)。固定間隔時間取樣，用于TLC、GC、HPLC分析，計(jì)算酯化率，SCA及1,3-DAG含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 香榧籽油的醇解

SCA以甘油三酯的形式存在于榧籽油中，純化富集前將其轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸(FFA)或脂肪酸乙酯(FAEE)是必要的。本研究通過酯交換反應(yīng)，即乙醇鈉催化TAG和過量乙醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)制備FAEE。與酸催化酯交換反應(yīng)相比堿催化具有溫度低(50～70 ℃)，速度較快(1～3 h)、轉(zhuǎn)化率高(>90%)等優(yōu)點(diǎn)[21-23]。55 ℃條件下乙醇鈉催化不同比例醇油比例混合物反應(yīng)1 h產(chǎn)物乙酯含量如圖1所示。

注：反應(yīng)溫度55 ℃、催化劑為乙醇鈉，添加量為總混合物重量的1%，反應(yīng)時間1 h。圖1 香榧籽油在不同乙醇/油比例條件下的醇解度

通常來講，過量乙醇有助于酯交換反應(yīng)平衡向乙酯生成方向轉(zhuǎn)化，促進(jìn)TAG醇解更徹底。圖1顯示，醇油體積比為0.25∶1(摩爾比為4.25∶1)時，乙酯濃度最高為93.8%。然而催化劑濃度不變，隨醇油比增加乙酯純度有所下降。醇油比15∶1時，乙酯產(chǎn)率僅為67.3%。這可能是因?yàn)檫^多的乙醇導(dǎo)致香榧油濃度降低，與催化劑分子的碰撞次數(shù)減少，因而有限的時間內(nèi)榧籽油醇解不充分。傅紅等富集魚油時也有類似的發(fā)現(xiàn)，其認(rèn)為要TAG充分醇解，醇油摩爾比不高于4.8是必要的[24]。當(dāng)醇油比固定在0.25∶1,反應(yīng)2 h醇解度從93.8%增大到97.8%，進(jìn)一步延長時間至3 h，5 h, 醇解度改變不明顯，表明反應(yīng)達(dá)到了動態(tài)平衡。因此后續(xù)反應(yīng)采用0.25∶1的醇油比在55 ℃下反應(yīng)2 h制備香榧籽油FAEE。

2.2 尿素包合富集金松酸乙酯

醇解得到的混合FAEE，實(shí)驗(yàn)采用尿素包合法純化SCA。尿素包合過程中尿素濃度、包合溫度、包合時間和酯脲比都會對最終目標(biāo)脂肪酸的純度有所影響，其中酯脲比最為重要[25]。為盡可能地富集并回收香榧籽油SCA，實(shí)驗(yàn)確定尿素濃度為40%，溶解溫度70 ℃，包合時間2 h。不同酯脲比條件下香榧油FAEE包合效果如圖2所示。產(chǎn)物的脂肪酸組成見圖3。

圖2 酯脲比對木榧油金松酸乙酯的包合效果

注：A包合前混合脂肪酸乙酯, B～F酯脲比分別為 0.2、0.3、0.35、0.4、0.5。圖3 不同酯脲比包合香榧油乙酯的GC圖

顯而易見，脂脲比對包合效果影響顯著。當(dāng)脂脲比為0.2時，包合產(chǎn)物中金松酸乙酯的純度最高，達(dá)78%，金松酸乙酯的回收率為36.4%。脂脲比提高到0.3，0.35時，金松酸乙酯的純度略有下降，分別為73.0%、63.8%。脂脲比為0.4時金松酸乙酯回收率高達(dá)98.6%，但金松酸乙酯純度卻降低至46.9%。0.3和0.35的酯脲比包合，金松酸乙酯的純度相差不多，但金松酸乙酯的回收率從43.0%顯著增加到87.0%。呂秋楠[27]和魯仲輝[26]等研究尿素包合法富集亞麻酸時亦有類似的發(fā)現(xiàn)。因此綜合考慮SCA純度、回收率以及經(jīng)濟(jì)性，脂脲比0.35包合木榧油乙酯是適宜的。

2.3 固定化脂肪酶無溶劑體系中催化FAEE、甘油合成1,3-DAG

以純化的金松酸乙酯和甘油為起始原料，研究探討了Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM及Novozyme 435的催化效果。不同溫度下的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)時間進(jìn)程曲線如圖4所示。

與Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM相比Novozym 435催化活性高，5～8 h后1,3-DAG即達(dá)到最大產(chǎn)率。隨溫度增加，Novozym 435催化活力明顯加快。50 ℃和60 ℃反應(yīng)5 h，1,3-DAG產(chǎn)率分別為30.1%和42.5%，而40 ℃時，反應(yīng)速率較低， 8 h后1,3-DAG產(chǎn)率達(dá)到最高(26.8%)。時間繼續(xù)延長1,3-DAG產(chǎn)率略有下降，且反應(yīng)趨向平衡。 Zeng[28]等在油酸與甘油合成1,3-DAG的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)。這可能是隨著反應(yīng)時間的延長，偏甘酯發(fā)生?；D(zhuǎn)移進(jìn)一步與EE反應(yīng)生成了TAG，1,3-DAG的含量從而降低。此外，也和Novozym 435不十分嚴(yán)格的1,3位置專一性有關(guān)[29-30]。Lipozyme TL IM催化選擇性可接受，但活力較低，而且其熱穩(wěn)定性較差，最適溫度為50 ℃，反應(yīng)24 h后1,3-DAG產(chǎn)率不足30%。

Lipozyme RM IM因在各種介質(zhì)中(無溶劑、有機(jī)溶劑，超臨界流體等)均表現(xiàn)出良好的的活性和穩(wěn)定性，因此廣泛應(yīng)用于油脂改性[31]。與Novozym 435類似，隨溫度增加Lipozyme RM IM活力上升明顯，60 ℃為其最適溫度。不同的是，因其位置選擇性高，隨時間延長1,3-DAG產(chǎn)率逐漸增。Luis Vázquez[32]等以混合脂肪酸乙酯為原料，在65 ℃下與甘油以2∶1摩爾比反應(yīng)，DAG得率為60.7%，1,3-DAG得率為39.8%。李磊[30]等研究米糠油甘油解制備1,3-DAG時發(fā)現(xiàn)60 ℃是Lipozyme RM IM的最佳溫度，溫度高于60 ℃時，DAG產(chǎn)量開始下降。Zhong[33]采用Lipozyme RM IM催化月桂酸、甘油酯化反應(yīng)合成1,3-DAG，當(dāng)酶添加量為5%，月桂酸和甘油摩爾比為2∶1，50 ℃下反應(yīng)3 h，1,3-二月桂酸酯得率為80.3%。Watanabe T等[34]也報道了Lipozyme RM IM在無溶劑體系中催化混合脂肪酸與甘油合成DAG的表現(xiàn)。5%的酶添加量，50 ℃下反應(yīng)4 h，DAG產(chǎn)率達(dá)84.0%，純度為90.0%。然而酯化反應(yīng)所用的游離脂肪酸制備需耗用大量的酸堿，環(huán)境問題突出。本研究采用5% Lipozyme RM IM做催化劑，F(xiàn)AEE、甘油摩爾比2∶1，60 ℃反應(yīng)24 h，產(chǎn)物中1,3-DAG產(chǎn)率達(dá)55.5%。

2.4 合成產(chǎn)物中的成分組成

三種脂肪酶不同溫度下催化酯交換反應(yīng)的選擇性如圖5所示。產(chǎn)物的脂肪酸組成見表1。甘油酯產(chǎn)物中1,3-DAG與1,2-DAG的比例反應(yīng)了酶催化位置選擇性的強(qiáng)弱。1,3-DAG/1,2-DAG比例越大，1,3-DAG含量越高，產(chǎn)物生理活性越高。圖5顯示，溫度升高后各脂肪酶合成產(chǎn)物中1,3-DAG/1,2-DAG的比例都增大，這與我們從前的的發(fā)現(xiàn)接近[35]。這可能是因?yàn)楦邷卮龠M(jìn)了1,2-DAG的Sn-2位脂肪酸向Sn-3位?；D(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)化為熱穩(wěn)定性更高的1,3-DAG[36]。因此在適當(dāng)范圍內(nèi)提高反應(yīng)溫度不僅能夠提高1,3-DAG的合成速率和產(chǎn)率，同時也能夠調(diào)整并改善二酯的比例。此外，數(shù)據(jù)也顯示3種酶的1,3-位置選擇性由強(qiáng)到弱依次為Lipozyme TL IM>Lipozyme RM IM>Novozym 435。Novozym 435的特異性最低，因此反應(yīng)后期乙酯與偏甘酯繼續(xù)反應(yīng)生成TAG，而Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM具有較高的位置特異性，脂肪酸因此很少結(jié)合在Sn-2位上，很難再合成TAG。

圖5 不同溫度下脂肪酶催化酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中的1,3-DAG/1,2-DAG的比例

制備1,3-DAG過程中，原料油、混合FAEE、包合富集的SAC乙酯以及不同脂肪酶最適條件下催化制備得到1,3-DAG的脂肪酸組成列于表1。結(jié)果顯示1,3-DAG的脂肪酸組成與包合富集的SAC乙酯原料無顯著差別，表明三種脂肪酶沒有表現(xiàn)出明顯的脂肪酸選擇性。1,3-DAG中SCA含量在58.6%～59.8%之間，符合預(yù)期。

表1 三種酶合成的1,3-DAG的脂肪酸組成

3 結(jié)論

采用乙醇鈉催化香榧油醇解高效、時間短，得到FAEE可方便地采用尿素包合法一步富集得到純度為60%～73% SCA乙酯。Lipozyme RM IM活力高、1,3-位置選擇性強(qiáng)是催化SCA乙脂、甘油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)最適合催化劑。當(dāng)添加量5%，乙酯、甘油摩爾比2∶1, 60 ℃反應(yīng)24 h，1,3-DAG產(chǎn)率達(dá)55.5%，其中金松酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.6%。實(shí)驗(yàn)開發(fā)的化學(xué)-酶催化兩步制備1,3-DAG的技術(shù)路線具有經(jīng)濟(jì)、高效、工藝綠色等優(yōu)點(diǎn)，具有一定的商業(yè)化潛力。