盧芙蓉 秦 鈾 沈 霖△ 帥 波 馬 陳 徐曉娟 廖 奕 楊艷萍

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430022

出血性血小板病是一組血小板聚集異常反復(fù)發(fā)作性出血性疾病，1984年由本院沈迪等人首次報(bào)告。本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，出血性血小板病患者血小板膜上的解離素金屬酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)17表達(dá)水平明顯升高。近年來研究[2-4]表明，非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein 2，iRhom2)是ADAM17關(guān)鍵的耦合子，iRhom2結(jié)合ADAM17，促進(jìn)ADAM17從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中外排并調(diào)控其活性?；诖耍狙芯窟M(jìn)一步觀察了益氣活血方治療出血性血小板病患者的臨床療效及iRhom2/ADAM17信號(hào)通路表達(dá)變化，旨在探討iRhom2是否參與了出血性血小板病的病理過程，以及健脾益氣活血法治療出血性血小板病的作用靶點(diǎn)?，F(xiàn)將過程報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月—2019年3月就診于本院中西醫(yī)結(jié)合科的出血性血小板病患者100例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥組與西藥組，各50例。中藥組，其中男17例，女33例；年齡(39.64±13.62)歲，年齡范圍為25～67歲；病程(5.68±3.32)年，病程范圍為2～13年；出血部位，皮膚瘀點(diǎn)瘀斑46例，月經(jīng)過多(每次月經(jīng)量估計(jì)在150 mL以上)13例，鼻出血12例，牙齦出血8例，眼底出血2例，球結(jié)膜出血2例。西藥組，其中男18例，女32例；年齡(37.52±14.18)歲，年齡范圍為23～68歲；病程(5.38±4.24)年，病程范圍為1～12年；出血部位，皮膚瘀點(diǎn)瘀斑47例，月經(jīng)過多11例，鼻出血10例，牙齦出血10例，眼底出血2例，球結(jié)膜出血1例。2組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

符合《益氣活血法治療出血性疾病》[5]中出血性血小板病相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者有多部位出血臨床表現(xiàn)，經(jīng)內(nèi)科、耳鼻喉科、婦科、口腔科和眼科等科室診視，未發(fā)現(xiàn)特異診斷性病灶；檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)、出血時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間，未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變；對(duì)一項(xiàng)或多項(xiàng)誘聚劑誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)不良或缺如；經(jīng)瑞斯托菌素(ristocetin)檢測(cè)血小板排除血小板無(wú)力癥。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：中藥組及西藥組患者符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；正常對(duì)照組體檢皮膚黏膜無(wú)出血癥狀，血小板聚集檢測(cè)無(wú)異常發(fā)現(xiàn)；2周內(nèi)未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀類中藥等影響血小板功能的藥物；患者及其家屬對(duì)本試驗(yàn)知情同意，并得到華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等重要臟器功能不全或血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；妊娠或哺乳期女性；依從性差，不能配合完成治療者。

1.4 治療方法

中藥組患者予以益氣活血方治療，方藥組成為黃芪15 g、黨參15 g、白芍15 g、當(dāng)歸10 g、桃仁10 g、甘草6 g；由本院門診中藥房煎制，1劑/d，分2次服用；治療期間停用其他影響血小板聚集或止血藥物。西藥組患者予以腎上腺色腙片(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32023285)口服，2.5 mg/片，2片/次，3次/d。2組患者療程均為8周。

1.5 觀察指標(biāo)及療效判定標(biāo)準(zhǔn)

比較2組患者止血療效，止血療效判定標(biāo)準(zhǔn)：治療后出血癥狀消失，月經(jīng)量恢復(fù)正常為顯效；臨床出血癥狀消失，停止治療8周后偶有肢體瘀斑或牙齦出血為有效；未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)效。止血總有效率=[(顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)]×100%。

比較2組患者血小板聚集率。采集患者肘靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，制備富含血小板血漿，以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)作為誘聚劑，用Chronolog 430型血小板聚集儀檢測(cè)患者血小板聚集最大聚集率。其中最大聚集率在21%～40%者為反應(yīng)不良，<20%者為反應(yīng)缺如。血小板聚集率療效標(biāo)準(zhǔn)：以血小板聚集率>40%為有效。

比較2組患者治療前后及正常對(duì)照組的血漿iRhom2、ADAM17、pro-ADAM17蛋白表達(dá)水平，采用蛋白印跡法(Western Blot)進(jìn)行檢測(cè)。采集患者肘靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，制備富含血小板血漿，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min；以12 000 rpm離心15 min后，收集上清，使用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，-80 ℃保存；上樣前加入上樣緩沖液，95 ℃煮沸5 min；每個(gè)樣本取30 μg蛋白上樣，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉常溫封閉30 min后，加入iRhom2、ADAM17和pro-ADAM17一抗，4 ℃孵育過夜；洗滌后加入辣根過氧化物酶連接的二抗，室溫下孵育45 min；ECL-Plus顯影曝光，用圖像分析軟件將其掃描并測(cè)定灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 iRhom2、ADAM17、pro-ADAM17蛋白表達(dá)水平比較

治療期間，中藥組有4例患者未完成觀察，其中2例治療期間服用其他止血藥，2例不愿抽血復(fù)查；西藥組有3例自認(rèn)為療效欠佳，服藥3～6 d后退出試驗(yàn)；故實(shí)際納入患者共93例。

治療前，中藥組與西藥組患者iRhom2與ADAM17蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。治療8周后，中藥組iRhom2與ADAM17蛋白表達(dá)水平較治療前明顯下降，且中藥組顯著低于西藥組(P<0.05)。見圖1。

A為治療前中藥組、西藥組與正常對(duì)照組比較；B為治療后中藥組與西藥組比較;1為ADAM17；2為pro-ADAM17；3為iRhom2；**P<0.05

2.2 止血療效比較

治療8周后，中藥組患者止血總有效率為84.78%，顯著高于西藥組的44.68 %(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者止血療效比較(例，%)

2.3 血小板聚集率恢復(fù)療效比較

治療8周后，中藥組患者血小板聚集率恢復(fù)正常者33例，血小板聚集率恢復(fù)療效為71.74%(33/46)；西藥組患者血小板聚集率恢復(fù)正常者3例，血小板聚集率恢復(fù)療效為6.38%(3/47)；組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

出血性血小板病是一組由血小板聚集功能異常所導(dǎo)致的出血性疾病，根據(jù)臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“血證”范疇。本課題組經(jīng)過多年臨床觀察[6-8]發(fā)現(xiàn)，本病患者多存在不同程度的脾虛癥狀，辨證屬脾不統(tǒng)血證，病機(jī)為脾氣虛弱、統(tǒng)攝無(wú)權(quán)，血不循經(jīng)而外溢，治宜健脾益氣、活血消瘀，可以選用益氣活血方或消瘀止血片進(jìn)行治療。

本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，該病患者的血管性血友病因子(vWF)和凝血酶共同受體即血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰ b/Ⅸ/Ⅴ及其亞基GPⅠ b α表達(dá)水平下調(diào)，其主要原因是ADAM17過度水解GPⅠ b α和GP Ⅴ胞外段功能區(qū)，導(dǎo)致血小板聚集不良。中藥益氣活血方治療該病療效顯著，可明顯抑制ADAM17對(duì)GPⅠ b α的過度水解。但是，出血性血小板病患者血小板為什么會(huì)出現(xiàn)ADAM17對(duì)凝血酶受體GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ及其亞基GPⅠ b α的過度水解,中藥是通過哪些關(guān)鍵作用靶點(diǎn)而達(dá)到抑制ADAM17對(duì)GP Ⅰ b α的過度水解功效的，有待進(jìn)一步探討。近年來研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，ADAM17的上游分子伴侶iRhom2能夠特異性地調(diào)節(jié)ADAM17轉(zhuǎn)運(yùn)、活化及胞外段蛋白水解功能[2]。iRhom2首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與ADAM17前體蛋白(pro-ADAM17)直接結(jié)合，一起轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，pro-ADAM17水解掉一段N端結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)化為成熟ADAM17，最后定位于細(xì)胞膜，完成蛋白水解[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，激活iRhom2/ADAM17信號(hào)通路，可加重血友病出血傾向，血液進(jìn)入關(guān)節(jié)，導(dǎo)致骨質(zhì)流失和滑膜炎。為此，本文采用蛋白印跡法觀察了iRhom2/ADAM17信號(hào)通路在出血性血小板病中的表達(dá)，同時(shí)研究益氣活血方對(duì)其的調(diào)節(jié)作用。

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，出血性血小板病患者的iRhom2和ADAM17蛋白表達(dá)水平明顯高于健康者，表明iRhom2/ADAM17信號(hào)通路異常表達(dá)參與了出血性血小板病的病理過程。本病治療前出血性血小板病患者的pro-ADAM17表達(dá)水平與健康者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步提示在出血性血小板病發(fā)病過程中，iRhom2通過與pro-ADAM17結(jié)合，激活了iRhom2/ADAM17信號(hào)通路，從而促進(jìn)血小板膜表面的ADAM17能夠介導(dǎo)GPⅠ b α和GP Ⅴ胞外功能區(qū)過度水解，引起血小板凝血酶受體GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物活性下降，導(dǎo)致血小板聚集缺陷，皮膚黏膜出血。中藥組治療8周后，iRhom2、ADAM17蛋白表達(dá)水平明顯下降，且顯著低于西藥組；提示益氣活血方部分抑制出血性血小板病患者ADAM17對(duì)血小板膜表面蛋白水解功能，可能是通過調(diào)控其上游基因iRhom2表達(dá)、功能或者活性這一關(guān)鍵靶點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，采用益氣活血方治療出血性血小板病患者，可顯著改善血小板聚集、提升止血效率。iRhom2/ADAM17信號(hào)通路參與了出血性血小板病的病理過程，調(diào)控iRhom2/ADAM17信號(hào)通路可能是益氣活血方治療出血性血小板病作用靶點(diǎn)之一。