孟 濤，宋佳陽，楊 墨，尉杰忠，段化偉

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué)附屬第一醫(yī)院，山西 大同 037006；3.中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050）

炭黑不僅是居民日常生活重要的細顆粒物污染源，而且職業(yè)暴露也較為廣泛。目前，國外研究者已將炭黑濃度納入大氣細顆粒物的監(jiān)測體系［1］，其所致的健康風(fēng)險、及其與疾病的關(guān)系一直是環(huán)境與健康領(lǐng)域研究的熱點。研究證實，細顆粒物暴露與呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化和肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2-4］，且認為細顆粒物的毒性效應(yīng)主要與其含有的有機物和重金屬組分有關(guān)，而未考慮碳核的毒性效應(yīng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)吸入單純炭黑，尤其是納米級炭黑可造成小鼠肺組織損傷［5-7］。盡管炭黑顆粒所致肺毒性機制尚不明確，但研究證實其損傷機制主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)［7-9］。

當(dāng)機體暴露于污染物時，會導(dǎo)致氧化損傷，同時也會啟動防御機制，通過上調(diào)抗氧化系統(tǒng)，以緩解細胞氧化損傷，該反應(yīng)是由抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）所調(diào)控。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）與ARE結(jié)合后，調(diào)控亞鐵血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1〔NAD（P）H quinone oxidoreductase-1，NQO-1〕和谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）等Ⅱ相抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，Nrf2/ARE通路是重要的抗氧化防御通路，其調(diào)控的抗氧化酶是污染物暴露和肺癌防治的重要標志物和治療靶點［10］。以往研究側(cè)重評估細顆粒物的全組分及有機提取物急性暴露后Nrf2/ARE調(diào)控的Ⅱ相抗氧化酶的變化［11-13］，但并未探討其核心組分碳核與Nrf2防御系統(tǒng)的關(guān)系。目前，關(guān)于單純炭黑暴露與Nrf2/ARE通路關(guān)系的報道較少，早期發(fā)現(xiàn)用炭黑處理人肺上皮細胞BEAS-2B后未誘導(dǎo)HO-1表達［14］，然而持續(xù)吸入炭黑是否會影響機體的Nrf2/ARE抗氧化防御系統(tǒng)尚不清楚。

為此，本研究選取高純度乙炔炭黑，建立炭黑氣溶膠全身吸入染毒小鼠模型，觀察肺組織的病理結(jié)構(gòu)變化，評估肺組織的損傷情況；檢測肺組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，探討炭黑對肺組織氧化應(yīng)激水平的影響；測定肺組織Nrf2及抗氧化酶HO-1，NQO-1和GCLC變化，分析炭黑對Nrf2氧化防御系統(tǒng)的影響。探討吸入炭黑氣溶膠對肺組織氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響，為炭黑所致肺損傷的毒性機制和防治藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

炭黑顆粒（焦作市和興化學(xué)工業(yè)有限公司，純度＞99.8%，呈球形，分散均勻，單顆粒尺寸30～50 nm，團聚顆粒尺寸200～400nm，比表面積74.85m2·g-1［5］）。ROS，SOD，GSH-Px，CAT和MDA檢測試劑盒、細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA強裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）（碧云天生物技術(shù)公司）；Trizol、SDS-PAGE預(yù)制膠、蛋白標準品、紫外分光光度計及蛋白電泳和印跡系統(tǒng)（美國Life公司）；PCR引物合成（上海英俊生物技術(shù)公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（美國Promega公司）；兔抗小鼠Nrf2、HO-1、NQO-1、GCLC、β肌動蛋白和組蛋白H1多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（美國Abcam公司）；底物化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國CST公司）；其余試劑均為國產(chǎn)生化試劑。氣溶膠發(fā)生裝置、動式全身吸入染毒裝置和質(zhì)量濃度監(jiān)測器（北京慧榮和科技發(fā)展有限公司）；顆粒粒徑分析儀（美國TSI公司）；酶標儀（美國Bio-Tek公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；低溫離心機（美國Sigma公司）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；化學(xué)發(fā)光分析儀（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）；切片機（德國Leica公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；X射線能譜儀（英國Oxford公司）。

1.2 動物

8周齡健康SPF級雄性C57BL/6小鼠30只（北京斯貝福實驗動物科技有限公司），合格證號：SCXK（京）2019-0010，體質(zhì)量20～25 g。在SPF級動物房內(nèi)適應(yīng)7 d，飼養(yǎng)溫度22～26℃，濕度45%～55%，保持12 h光照。除吸入染毒外，不限制動物活動和進食飲水，且實驗操作遵循實驗動物的管理條例。

1.3 吸入染毒模型的建立和實驗分組

將炭黑烘烤后加入氣溶膠發(fā)生裝置，并與全身吸入柜相連接。依據(jù)炭黑職業(yè)人群暴露濃度［15］，設(shè)定炭黑氣溶膠濃度（15和30 mg·m-3），待濃度穩(wěn)定后將小鼠置吸入柜內(nèi)，每天染毒6 h，連續(xù)染毒14 d，利用濾膜稱重法動態(tài)測定吸入柜中炭黑氣溶膠濃度分別為15.06±2.15和（29.61±3.40）mg·m-3。粒徑分析儀監(jiān)測吸入柜內(nèi)炭黑的粒徑分布，其中粒徑＜100 nm的顆粒占15.00%，＜400 nm的顆粒占81.68%。正常對照組小鼠以同樣暴露方式給予過濾空氣。每組共10只小鼠，末次染毒后，將小鼠麻醉后處死，取肺組織，分別用于組織病理檢查（n=3）和電鏡檢查（n=1）和氧化應(yīng)激指標、mRNA和蛋白表達的測定（n=6）。

1.4 HE染色和電鏡檢測肺組織病理變化及X射線能譜儀分析肺組織微區(qū)元素

小鼠麻醉后，行全身灌注和固定，解剖取肺，制備石蠟切片，行HE染色后光鏡下觀察肺組織學(xué)改變，每張切片觀察10個視野，依據(jù)毛細血管充血、中性粒細胞滲出、支氣管纖毛及上皮損傷、肺間隔增寬、肺泡腔內(nèi)纖維蛋白滲出等5項指標進行0～4半定量評分，并計算總分。制備1 mm3肺組織切塊，于4℃保存和固定，經(jīng)漂洗、固定、染色、脫水、切片及再染色，透射電鏡觀察肺超微組織結(jié)構(gòu)。采用透射電鏡選取肺組織顆粒沉積區(qū)域作為目標微區(qū)，由于各種元素具有X射線的特征性波長，通過X射線能譜儀對目標區(qū)域進行元素種類及含量分析。

1.5 化學(xué)熒光法檢測肺組織單細胞ROS含量

各組取同一部位肺組織30 mg，冰浴條件下制備肺組織單細胞懸液，用熒光探針DCFH-DA 37℃孵育20 min，PBS洗3次后重懸，實驗設(shè)不加探針的平行管。流式細胞儀測定肺組織單細胞懸液中ROS水平。

1.6 ELISA法檢測肺組織SOD，GSH-Px和CAT活性及MDA含量

取約30 mg肺組織，制備10%組織勻漿液，按照試劑盒說明，用酶標儀分別檢測抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活性及MDA的含量。

1.7 熒光定量PCR法檢測肺組織Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC mRNA表達水平

取約30 mg肺組織，Trizol法提取肺組織總RNA，用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，OD 260/280比值在1.8～2.0之間。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在QS12K熒光定量PCR系統(tǒng)下，擴增目的基因（Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC）和內(nèi)參基因β肌動蛋白。引物序列詳見表1，并用2-ΔΔCT法計算各目的基因的表達量。

1.8 Western印跡法檢測肺組織Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC蛋白表達水平

取20 mg新鮮肺組織，按照試劑說明抽提同一樣品的胞核和胞質(zhì)蛋白，檢測細胞不同部位Nrf2的表達。取30 mg凍存肺組織，加入RIPA裂解液（含1 mmol·L-1PMSF），冰上充分研磨和靜置，4℃、14 000×g離心10 min，取上清后用BCA法測定蛋白濃度，高溫變性后-20℃保存。使用Life預(yù)制膠，加樣10 mg后經(jīng)垂直電泳及恒壓轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜用5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。加入一抗HO-1 為1∶2000，Nrf2，NQO-1 和GCLC 均為 1∶1000，并以組蛋白H1和β肌動蛋白（均為1∶1000）分別作為胞核和胞質(zhì)蛋白的內(nèi)參，4℃孵育過夜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶20 000），37℃孵育1 h，使用底物化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并采用化學(xué)發(fā)光儀讀取和拍照，用Image J軟件分析，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度的比值表示目標蛋白的表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，且滿足方差齊性結(jié)果，以±s表示。3組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，相關(guān)性用Pearson分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炭黑對小鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)的影響

如圖1A所示，小鼠連續(xù)14 d吸入炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3后，肺組織顏色變黑、質(zhì)地變硬，29.61 mg·m-3組肺組織變化更為顯著。圖1B所示，正常對照組小鼠肺泡和細支氣管壁結(jié)構(gòu)完整，管腔內(nèi)無滲出物；炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3組肺泡和細支氣管壁結(jié)構(gòu)紊亂，肺間隔、肺泡及細支氣管腔內(nèi)出現(xiàn)少至多量黑色顆粒及吞噬顆粒的巨噬細胞，并出現(xiàn)毛細血管充血、炎細胞浸潤、肺泡和支氣管上皮和纖毛受損、及肺間隔增厚等病理變化。圖1C所示，正常對照組小鼠肺巨噬細胞中各細胞器結(jié)構(gòu)完整，僅見少量初級溶酶體，而炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3組肺巨噬細胞含有大量初級和次級溶酶體，線粒體腫脹且嵴被破壞，胞質(zhì)含空泡和自噬體，胞膜、胞質(zhì)及溶酶體內(nèi)可見較多黑色顆粒。通過X射線電子能譜分析結(jié)果表明，顆粒沉積微區(qū)的元素組成為碳、氧、鉛、氮，其中碳含量為（90±4）%，證實黑色顆粒成分主要為碳元素，即為炭黑顆粒。

炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3組小鼠肺損傷評分分別為5.62±1.13和7.63±1.26，顯著高于正常對照組1.90±0.26（P＜0.01），且29.61 mg·m-3組肺組織損傷程度比15.06 mg·m-3組更為嚴重（P＜0.05）。

2.2 炭黑對小鼠肺組織氧化應(yīng)激指標的影響

由圖2A～E可見，與正常對照組〔細胞內(nèi)ROS平均熒光強度：226±51.4；SOD：（4.5±0.8）kU·g-1；GSH-Px：（108±19.2）kU·g-1；CAT：（9.1±1.5）kU·g-1；MDA：（13.4±2.8）μmol·g-1〕相比，吸入炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-314 d后，小鼠肺組織單細胞內(nèi)ROS含量分別上升至455±120和526±98.2（P＜0.01），SOD活性分別下降至（3.5±0.9）和（3.2±0.8）kU·g-1，GSH-Px活性分別下降至（89.0±14.5）和（84.3±10.4）kU·g-1，CAT活性分別下降至（7.5±1.2）和（7.1±1.0）kU·g-1，MDA含量分別上升至（16.8±2.1）和（17.3±2.0）μmol·g-1（P＜0.05）。與15.06 mg·m-3組相比，29.61 mg·m-3組 SOD，GSH-Px和CAT活性有下降趨勢，細胞內(nèi)ROS和肺組織MDA含量有升高趨勢，但無顯著差異。

Fig.1 Effect of carbon black（CB）aerosol exposure on histopathology and ultrastructure of lung tissue in mice.The mice were exposed to CB aerosols（15.06 and 29.61 mg·m-3）orfiltered air for 6 h per day for a continuous inhalation of 14 d.A：images of lung tissue；B：histopathology of lung tissue by HE staining；C：ultrastructure of lung tissue by transmission electron microscope examination.The red arrows indicate the CB particles in lung tissue and the green arrows indicate the lung macrophage.

Fig.2 Effect of CB aerosol exposure on intracellular reactive oxygen species（ROS，A）content，superoxide dismutase（SOD，B），glutathione peroxidase（GSH-Px，C），catalase（CAT，D）activities，and malondialdehyde（MDA，E）content of lung tissue in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 炭黑對小鼠肺組織Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC mRNA表達的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3組肺組織Nrf2 mRNA表達分別為（99±19）%和（110±21）%，無顯著差異；HO-1，NQO-1和GCLC mRNA表達水平分別顯著上調(diào)至（190±47）%和（235±68）%（P＜0.01）、（151±34）%和（168±28）%（P＜0.05）、以及（143±25）%和（193±46）%（P＜0.05）；且炭黑氣溶膠 29.61 mg·m-3組GCLC mRNA表達上調(diào)比15.06 mg·m-3組更為明顯（P＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示，HO-1，NQO-1和GCLCmRNA水平與ROS水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.785，0.699和0.720。

Fig.3 Effect of CB aerosol exposure on mRNA levels of Nrf2，HO-1，NQO-1 and GCLC of lung tissue in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CB 15.06 mg·m-3group.

2.4 炭黑對小鼠肺組織Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC蛋白表達的影響

如圖4所示，與正常對照組相比〔HO-1：（102±6）%；NQO-1：（98±4）%；GCLC：（102±8）%〕，炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3組肺組織中Nrf2調(diào)控的抗氧化酶蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），其中HO-1分別上調(diào)至（136±13）%和（165±12）%，NQO-1分別上調(diào)至（118±8）%和（126±10）%，GCLC分別上調(diào)至（130±11）%和（145±18）%。盡管肺組織Nrf2蛋白總體表達水平未見顯著變化，但胞質(zhì)Nrf2水平明顯降低（P＜0.05）而胞核Nrf2水平明顯增加（P＜0.01）。與正常對照組相比〔胞質(zhì)Nrf2：（95±8）%；胞核Nrf2：（109±12）%〕，炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-3組肺組織胞質(zhì)Nrf2下調(diào)至（74±12）%和（37±22）%，而胞核Nrf2上調(diào)至（251±36）%和（315±46）%。此外，HO-1及胞質(zhì)和胞核中Nrf2蛋白水平在不同劑量組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of CB aerosol exposure on protein levels of Nrf2，HO-1，NQO-1 and GCLC of lung tissue in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.D was the semiquantitative result of A-C.x ± s，n=6. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CB 15.06 mg·m-3group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，吸入炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-314 d后，肺組織細胞內(nèi)可見炭黑顆粒和吞噬炭黑顆粒的巨噬細胞，由于持續(xù)吸入造成沉積于肺組織的炭黑數(shù)量較多，遠超過巨噬細胞的清除能力，這些未被吞噬的顆粒和活化的巨噬細胞造成肺組織毛細血管充血、中性粒細胞浸潤、上皮及纖毛的破壞、肺間隔增厚等多種損傷性變化。

體外和體內(nèi)研究表明，炭黑顆粒所致機體的生物學(xué)效應(yīng)主要是由氧化應(yīng)激所觸發(fā)，即氧化應(yīng)激是引起炭黑顆粒所致肺損傷的早期關(guān)鍵生物學(xué)事件［7-9］。過去研究更多關(guān)注急性或短期接觸炭黑顆粒物后機體氧化與抗氧化水平的失衡，且絕大多數(shù)動物模型采用氣管滴注造模，而本研究利用動式吸入模型，反復(fù)吸入炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-314 d后，對肺組織造成不同程度地氧化損傷，表現(xiàn)為細胞內(nèi)ROS水平升高，肺組織SOD，GSH-Px和CAT活性下降，表明連續(xù)吸入炭黑氣溶膠可導(dǎo)致肺組織抗氧化能力下降，打破機體的氧化和抗氧化平衡，誘導(dǎo)持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并加劇ROS對細胞內(nèi)生物大分子的氧化損傷，本次研究也證實，持續(xù)吸入炭黑后肺組織的氧化產(chǎn)物MDA水平增加。

然而，以往研究重點關(guān)注炭黑顆粒所致機體的氧化應(yīng)激與氧化損傷，并未探討持續(xù)接觸炭黑后機體氧化防御系統(tǒng)的變化、以及與暴露的關(guān)系。顆粒物暴露后先觸發(fā)氧化應(yīng)激，隨之啟動抗氧化防御系統(tǒng)，保護細胞免受氧化損傷，其中Nrf2/ARE通路是機體極為重要的氧化防御通路［16］。前期研究證實，細顆粒全組分及其有機提取物可影響小鼠肺組織Nrf2及抗氧化酶的表達［11-13］，但并未明確核心碳核與氧化防御的關(guān)系。本研究利用吸入染毒模型探討炭黑持續(xù)暴露后小鼠肺組織Nrf2及其抗氧酶的變化，并分析這些變化與暴露劑量的關(guān)系。實驗結(jié)果證實，持續(xù)吸入炭黑氣溶膠會促使Nrf2從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核，上調(diào)Ⅱ相抗氧化酶HO-1，NQO-1和GCLC mRNA和蛋白表達，且隨著暴露劑量增加抗氧化酶上調(diào)水平更為顯著，說明持續(xù)暴露炭黑14 d后可激活機體的Nrf2氧化防御系統(tǒng)。但也有體外研究證實，用炭黑處理人肺上皮細胞后，HO-1表達水平無顯著變化［14］。這一結(jié)果的差異可能與研究對象、炭黑粒徑、暴露劑量、暴露時間和暴露方式等有關(guān)。

ROS是調(diào)節(jié)氧化防御通路中重要的第二信使，其中Nrf2在ROS的調(diào)節(jié)下可以被迅速活化。正常情況下，Nrf2存在于胞質(zhì)中，與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）耦聯(lián)形成Keap1-Nrf2復(fù)合物，阻止Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。當(dāng)細胞受到顆粒物刺激后，ROS氧化Keap1活性位點，改變Keap1構(gòu)象，使Keap1-Nrf2發(fā)生解離，隨之游離Nrf2被轉(zhuǎn)到核內(nèi)，與ARE元件結(jié)合，調(diào)控多種抗氧化酶的表達，而這些酶是氧化防御的重要標志物［17］。本研究證實，吸入炭黑氣溶膠后誘導(dǎo)肺組織單細胞ROS水平顯著增加，且ROS水平與HO-1，NQO-1和GCLC mRNA水平顯著正相關(guān)，但并未證實ROS和Nrf2調(diào)控的關(guān)系，后續(xù)將利用體外模型探討Nrf2的上游調(diào)控機制。盡管Nrf2的mRNA和蛋白總體水平未見顯著變化，但胞核Nrf2水平增加，而胞質(zhì)Nrf2水平降低，提示活化的Nrf2水平增加，并上調(diào)Ⅱ相抗氧化酶的表達。此外，本研究僅觀察炭黑氣溶膠吸入14 d小鼠肺組織抗氧化防御系統(tǒng)的變化，后續(xù)將重點關(guān)注炭黑暴露后Nrf2及其抗氧化酶的時間依賴性變化。

綜上所述，連續(xù)吸入炭黑氣溶膠15.06和29.61 mg·m-314 d后，小鼠肺組織和細胞內(nèi)出現(xiàn)炭黑顆粒，造成肺組織氧化應(yīng)激，并激活抗氧化防御系統(tǒng)，使Nrf2從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進入胞核，激發(fā)Nrf2的活性，上調(diào)抗氧化酶HO-1，NQO-1和GCLC表達。本研究結(jié)果為炭黑顆粒所致肺疾病的防治提供新思路和治療靶點，并為解析細顆粒物不同組分的健康危害及防治提供實驗依據(jù)。