張文婷，彭仁軍，善亞君，左宗超，從玉文，王麗梅，唐 麗，3

（1.安徽醫(yī)科大研究生院，安徽 合肥 230032；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所北京市放射生物學重點實驗室，北京 100850；3.生命組學研究所，北京 102206）

粒細胞是血液的重要組成成分，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮非特異性或特異性抗感染作用。此外，再生障礙性貧血、先天或后天導致的粒細胞減少癥，白血病和癌癥放化療等均會導致骨髓造血損傷，其中粒細胞減少癥會造成骨髓增生異常，脾腫大以及嚴重的體內感染等［1］。粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是重要的造血調控因子，是促進粒細胞生成的重要因子，具有促進造血動員的作用［2］。重組人G-CSF（recombinant human G-CSF，rhG-CSF）在臨床上應用廣泛［3-4］，如作為白血病、乳腺癌等腫瘤化療后的升高體內的白細胞作用和作為造血動員劑應用在骨髓造血干細胞移植中。但rhG-CSF多由外源性的大腸桿菌或CHO細胞生產，人體多次使用后會產生內源性抗體，降低療效［5］；rhG-CSF在體內給藥半衰期短，并有皮疹、潮紅和骨疼等副作用［6-7］。因此，尋找一種有效、安全、有效時間長的小分子化合物，通過刺激內源性G-CSF生成來治療粒細胞減少癥、促進造血動員作用等一直受到國內外學者的關注。

δ-生育三烯酚（δ-tocotrienol，δ-T3H）屬于維生素E類化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H具有抗氧化、降低膽固醇合成、抗癌和抗輻射損傷等生物學作用［8-10］。據報道，δ-T3H可促進電離輻射后全血細胞恢復，使用G-CSF中和抗體后此作用消失，提示δ-T3H通過誘導體內G-CSF水平的升高而促進造血［11-12］。然而，在正常情況下，δ-T3H 促進G-CSF生成的作用以及促進粒細胞升高的作用還不清楚。為此，本研究采用酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），外周血血常規(guī)檢測和流式細胞術等多種方法，系統(tǒng)評價δ-T3H誘導正常小鼠體內G-CSF生成的劑量時間效應，組織選擇性和相對專一性，進一步探討δ-T3H升高正常健康小鼠外周血粒細胞的效應和造血活性，為δ-T3H作為一種新型升粒細胞小分子化合物，應用于粒細胞減少癥等相關疾病的研究提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和主要儀器

6～8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體質量20～23 g（北京華阜康生物科技股份有限公司），動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。光照每12 h晝夜交替，溫度22～26℃，濕度40%～70%。

δ-T3H（北京三區(qū)生物技術有限公司）；G-CSF ELISA試劑盒（美國Ray Biotech公司）；細胞趨化因子1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、粒巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）和基質細胞衍生因子β（stromal cellderived factor-1β，SDF-1β）ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司）；聚乙二醇-400（PEG400）（國藥集團化學試劑有限公司）；乙二酸四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）緩沖液和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）（美國Gibco公司）。CD117-APC（C-kit）抗體，Ly-6A/E-PE-Cy7（Sca-1）和 Lineage〔CD3/Gr-1/CD11b/CD45R（B220）〕-FITC抗體（美國eBioscience公司）。

酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）；Celltac E自動血細胞分析儀（日本Nihon Kohden公司）；電子天平（上海醫(yī)療器械公司）；高速離心機（美國Sigma公司）；流式細胞分析儀（美國BD公司）。

1.2 ELlSA檢測小鼠血清中G-CSF細胞因子的含量

為檢測δ-T3H的劑量效應，取C57BL/6J小鼠30只，隨機分為6組（每組5只），即正常對照組，δ-T3H 12.5，25，50，100和200 mg·kg-1組，在給藥后24 h，小鼠給予ip注射3%戊巴比妥鈉麻醉后進行心臟采血。全血標本收集在不加抗凝劑的1.5 mL EP管中，室溫置2 h后，1000×g離心10 min。吸取上清液，立即檢測或分裝儲存在-80℃冰箱內，血清標本應避免反復凍融。按G-CSF ELISA試劑盒說明書對小鼠血清中G-CSF含量進行檢測。將樣本和標準品分別加入反應孔，依次加相應的檢測抗體，室溫孵育1.5 h；洗滌后加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min；加底物顯色液室溫孵育15 min；加終止液。使用酶標儀檢測各組吸光值。按說明書公式計算其濃度。

1.3 ELlSA法檢測小鼠血清中G-CSF，CXCL1，GM-CSF，lL-6，lL-10，lL-12，TNF- α，EPO，TPO和SDF-1 β細胞因子的水平

取C57BL/6J小鼠25只，隨機分為2組，即正常對照組（5只），δ-T3H（100 mg·kg-1）連續(xù)5 d sc給藥組（20只），按照給藥后1，3，5和7 d每個時間點5只小鼠收集血清，利用ELISA試劑盒檢測血清中G-CSF，EPO，TPO，SDF-1β。另取C57小鼠45只，隨機分為2組，正常對照組（5只），δ-T3H（100mg·kg-1）單次sc給藥組（40只），給藥組按照3，6，12，24，36，48，72和96 h時間點進行心臟采血，每個采血點5只小鼠。利用ELISA試劑盒檢測血清中G-CSF，CXCL1，GM-CSF，IL-6，IL-10，IL-12和TNF-α水平。實驗步驟見1.2。

1.4 ELlSA法檢測小鼠臟器組織勻漿中G-CSF細胞因子水平

雄性C57BL/6J小鼠10只，隨機分為2組（每組5只），即正常對照組和δ-T3H（100 mg·kg-1）組，給藥后24 h進行組織勻漿上清液制備。小鼠脫頸處死，取組織臟器。新鮮組織置預冷的1%PBS中。首先使用預冷的1%PBS沖洗空腸、肝、肺和腎等臟器。然后分別稱取100 mg組織剪碎后加1 mL預冷1%PBS緩沖液，在研缽中利用組織研磨棒磨碎制成組織勻漿液，-20℃過夜保存；脾、胸腺、骨髓、腸系膜結節(jié)和淋巴結組織加1 mL 1%PBS緩沖液預冷，利用組織研磨棒研磨成細胞懸液。最后，組織裂解標本反復凍融2次以破壞其細胞膜，將勻漿置4℃環(huán)境中500×g離心5 min，吸取上清液，立即檢測或分裝凍存于-80℃冰箱內備用。利用G-CSF ELISA試劑盒說明書對小鼠組織勻漿中G-CSF含量進行檢測。實驗步驟見1.2

1.5 全血細胞分析儀檢測小鼠外周血常規(guī)參數

雄性C57小鼠16只，隨機分為2組（每組8只），即正常對照組和δ-T3H（100 mg·kg-1）組。小鼠連續(xù)sc給藥5 d后，按0，1，4，7，10，14，18，22和28 d進行小鼠尾靜脈采血，將小鼠置小鼠固定器中，露出鼠尾，先找出小鼠尾靜脈，用刀片輕輕劃開小鼠尾靜脈，再用毛細血管吸取10 μL靜脈血，并將其加入2 mL稀釋液中混勻，最后利用血細胞分析儀檢測并得出結果。

1.6 流式細胞術檢測小鼠外周血造血干細胞數量

雄性C57小鼠15只，隨機分為3組，每組5只。即正常對照組，δ-T3H 100 mg·kg-1單次sc給藥組和δ-T3H 100 mg·kg-1連續(xù)2 d sc給藥組。藥后24 h采血，小鼠給予ip注射3%戊巴比妥鈉麻醉后進行心臟采血，全血標本收集在加EDTA抗凝劑的EP管中備用。采集的小鼠外周血按1∶9比例加紅細胞裂解液，室溫條件下裂解30 min；室溫下500×g，離心5 min，棄上清液，1%BSA PBS洗1遍，離心條件同上；加Lineage、C-kit、Sca-1抗體（1∶50）后4℃孵育30 min；1%BSA PBS清洗1遍；然后加7-AAD染料避光染色5 min；最后加500 μL無血清1640，過濾到流式管，流式細胞儀檢測外周血中造血干細胞數量。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 δ-T3H單次給藥對小鼠血清中G-CSF含量的影響

δ-T3H 12.5 mg·kg-1可顯著增加血清中G-CSF含量（P＜0.05）（圖1A），隨著δ-T3H給藥劑量的增加，血清中G-CSF含量隨給藥劑量增加而明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），當δ-T3H給藥劑量為100 mg·kg-1時，G-CSF生成達到飽和值（38.6±4.4）μg·L-1。小鼠sc給予δ-T3H 100 mg·kg-1，給藥后3 h，小鼠血清中G-CSF含量即顯著升高，且隨時間的延長繼續(xù)升高（圖1B），在給藥后24 h達峰值（36±12）μg·L-1后維持到給藥后48 h；72 h時血清G-CSF含量已相對含量最高值明顯降低，但至96 h時，血清G-CSF含量（8.8±4.1）μg·L-1依然顯著高于正常對照組G-CSF含量水平（0.4±0.1）μg·L-1（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of δ-tocotrienol（ δ-T3H）on serum granulocyte colony-stimulating factor（G-CSF）levels in mice by ELlSA.A：mice subcutaneously received δ-T3H administered at escalating doses（from 0 to 200 mg·kg-1）and serum G-CSF levels were measured 24 h later；B：mice received a single dose of δ-T3H 100 mg·kg-1and serum G-CSF levels were measured at indicated time points.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 0 mg·kg-1group.

2.2 δ-T3H單次給藥對小鼠血清炎癥相關細胞因子生成的影響

δ-T3H給藥后3 h，小鼠血清CXCL1含量顯著升高（P＜0.05）（圖2），6 h達峰值（1.4±0.5）μg·L-1，并持續(xù)到24 h，給藥后36 h降到已接近正常值水平（0.23±0.03）μg·L-1。IL-12和IL-10分別于δ-T3H給藥后36 h和48 h有一過性降低，而GM-CSF，TNF-α和IL-6的血清含量在δ-T3H給后不同時間點均無顯著變化。

2.3 δ-T3H單次給藥對小鼠不同組織器官G-CSF含量的影響

正常對照組小鼠肝和腎G-CSF含量最高（圖3A），其次為小腸和肺組織，胸腺、脾、淋巴結和骨髓組織G-CSF含量相對較低；δ-T3H給藥24 h后，小鼠胸腺、脾、淋巴結和骨髓組織G-CSF含量較正常對照組明顯增加（P＜0.05），而肝、腎、小腸和肺組織G-CSF含量無顯著變化。

2.4 δ-T3H連續(xù)給藥對小鼠血清造血調控相關細胞因子含量的影響

δ-T3H連續(xù)sc給藥5 d，小鼠血清G-CSF含量持續(xù)維持在較高水平〔（35.5±0.1）μg·L-1〕（圖4），停藥后2 d有明顯降低〔（19.4±4.3）μg·L-1〕，但仍保持顯著高（P＜0.01）；給藥期間TPO和EPO也有所升高，但升高幅度有限；而誘導干細胞遷移的SDF-1β在給藥期間及給藥后均無明顯變化。

Fig.2 Effect of δ-T3H on serum CXCL1，GM-CSF，TNF- α，lL-6，lL-10 and lL-12 levels in mice by ELlSA.Mice received a single dose of δ-T3H（100 mg·kg-1）and serum inflammation-related cytokines were measured at indicated time points then.CXCL1：C-X-C motif chemokine ligand 1；GM-CSF：granulocyte macrophage colony stimulating factor；TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL-6：interleukin-6.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control（0 h）group

Fig.3 Effect of δ-T3H on G-CSF levels in different tissue homogenate of mice by ELlSA.Mice were treated with vehicle or δ-T3H（100 mg·kg-1）by subcutaneous injection,subsequent measurement of G-CSF levels in different organs was performed 24 h later.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 δ-T3H連續(xù)給藥對小鼠外周血參數的影響

外周血白細胞在開始給藥后第3～18天期間顯著高于正常對照組（P＜0.05，P＜0.01），給藥后14 d達峰值，較正常對照組升高了6倍，隨后降至正常水平（圖5）。中性粒細胞在給藥期間顯著高于正常對照組水平（P＜0.01），給藥后第3天顯著升高，14 d達峰值，22 d顯著降低，隨后降至正常水平。外周血單核細胞在開始給藥后第1天即開始升高（P＜0.05，P＜0.01），停藥后仍持續(xù)增加，給藥后第7天達峰值，隨后緩慢降低，至22 d降至正常水平。外周血淋巴細胞在給藥后5至10 d明顯低于正常對照組（P＜0.05），隨后恢復到正常水平。血小板呈現(xiàn)兩個升高峰，一是在給藥后第3天明顯高于正常對照組（P＜0.01），隨后降低；二是在給藥后14～22 d明顯高于正常對照組（P＜0.05），隨后降到正常水平。紅細胞在給藥后10～28 d均明顯低于正常對照組（P＜0.05，P＜0.01），但仍維持在正常值范圍內，未表現(xiàn)出明顯的貧血癥狀。

Fig.4 Effect of δ-T3H on serum G-CSF，EPO，SDF-1 β，TPO levels in mice by ELlSA.Mice were sc injected with δ-T3H（100 mg·kg-1）for 5 d and serum hematopoietic related cytokines were measured at indicated time points then.EPO：erythropoietin；SDF-1β：stromal cell-derived factor-1β ；TPO：thrombopoietin.x± s，n=5. ＊＊P＜0.01，compared with normal control（0 h）group.

2.6 δ-T3H單次給藥對小鼠外周血壓造血干細胞的數量的影響

如圖6所示，δ-T3H單次sc給藥組小鼠外周血單核細胞數量明顯升高（P＜0.01），δ-T3H連續(xù)2 d sc給藥組升高單核細胞數更顯著（P＜0.01）。流式細胞術分析外周血造血干細胞LSK（Lin-Sca1+C-Kit+）和祖細胞LK（Lin-Sca1-C-Kit+）的數量，與正常對照組相比，δ-T3H連續(xù)2 d sc給藥組LSK數量顯著增加（P＜0.01），單次sc給藥組LK數量略有降低，但無統(tǒng)計差異。表明δ-T3H可能通過誘導體內G-CSF生成動員小鼠骨髓造血干細胞進入外周血，促進外周血造血干細胞數量的增加。

Fig.5 Effect of δ-T3H on peripheral blood counts in mice.Mice were sc injected with vehicle or δ-T3H（100 mg·kg-1）for 5 d，peripheral blood cells were counted at indicated time points.x ± s，n=8. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.6 Effect of δ-T3H on numbers of hematopoietic stem cells in peripheral blood analyzed by flow cytometry.δ-T3H 100 mg·kg-1was sc administered at a single dose or once day for 2 d.±s,n=5.＊P＜0.05,＊＊P＜0.01,compared with normal control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H促進內源性G-CSF生成具有劑量和時間依賴效應。且通過檢測小鼠血清中其他細胞因子發(fā)現(xiàn)，δ-T3H促進小鼠體內G-CSF生成具有相對專一性。研究發(fā)現(xiàn)δ-T3H能顯著增加小鼠淋巴-造血組織如胸腺、脾、淋巴結和骨髓組織液中的G-CSF含量，在一定范圍內促進造血相關細胞因子生成。另外δ-T3H能顯著促進小鼠外周血粒細胞的生成，促進外周血造血干細胞的生成，具有一定的造血活性。

G-CSF是骨髓造血的重要調節(jié)因子，重組人G-CSF在粒細胞減少癥、造血干細胞動員等方面具有明確的療效，粒細胞減少癥患者一般會產生機體內的感染導致相關炎癥細胞因子的改變［13］。臨床上多應用G-CSF治療粒細胞減少癥，但存在免疫原性和安全性隱患［14］。δ-T3H作為自然存在的維生素E類小分子化合物，在胭脂果油中含量豐富，易于獲得［15］。研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H除對小鼠中性粒細胞趨化因子CXCL1生成有一定的促進作用外，不影響其他細胞因子如GM-CSF，TNF-α，IL-6，IL-10和IL-12的生成。δ-T3H作為抗炎的小分子化合物通過MAPK和PPAR信號通路抑制NF-κB活性，抑制促炎細胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-1β和 IL-6）的產生［16］。δ-T3H作為放射防護劑通過刺激體內G-CSF的生成而產生放射防護作用［11］。但δ-T3H誘導體內G-CSF生成的效應細胞及信號通路還有待于進一步研究。既往文獻報道生育三烯酚通過單核-巨噬細胞、內皮細胞、基質細胞等誘導生成G-CSF［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H可顯著增加小鼠淋巴-造血組織如胸腺、脾、淋巴結和骨髓組織的G-CSF含量。所以δ-T3H有可能通過誘導體內內源性G-CSF生成作用而應用在腫瘤放化療導致的炎癥感染和粒細胞減少癥等疾病中。

G-CSF臨床應用在自體或異體造血干細胞移植，G-CSF能動員骨髓造血干細胞進入血液的骨髓靜脈竇的近端和遠端細胞，同時有效減少并發(fā)癥的產生［19］。檢測血清中G-CSF作為造血細胞因子與其他造血相關細胞因子的含量，發(fā)現(xiàn)δ-T3H連續(xù)給藥后在一定范圍內促進小鼠血清中TPO和EPO升高，能持續(xù)性維持機體內高水平的G-CSF含量。另外，δ-T3H連續(xù)給藥5 d后，小鼠外周血白細胞、中性粒細胞和單核細胞顯著增加，說明δ-T3H通過升高G-CSF動員單核細胞和中性粒細胞進入外周血，而且對髓系造血干、祖細胞也有促增殖作用。本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H給藥期間及給藥后淋巴細胞和紅細胞計數較對照組有一過性降低，其作用機制尚不清楚。G-CSF作為造血動員劑存在高達30%的概率對健康機體的G-CSF無反應，這樣就需要另選用高成本的藥物普利沙福（plerixafor），無疑增加了患病者的醫(yī)藥負擔［20］。據報道諸如鈷原卟啉Ⅸ通過增加內源性G-CSF，動員骨髓造血干細胞和粒細胞進入外周血，但其光毒副作用及其生物利用度等弊端還需進一步優(yōu)化［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，δ-T3H作為小分子化合物能通過升高小鼠外周血造血干細胞數而促進體內造血活性，δ-T3H有望作為造血動員劑動員骨髓造血干細胞入血。

δ-T3H作為脂質維生素類小分子化合物，有可能會在體內轉化成其他形式的維生素E類而降低療效。盡管δ-T3H有促進健康機體中G-CSF含量的升高和促進粒細胞升高的作用，但其效應細胞和作用機制，還需利用生物細胞技術以及基因敲除技術進一步研究。但δ-T3H促進G-CSF生成及其促造血活性的能力提示其在腫瘤放、化療引起的中性粒細胞減少癥、造血干細胞動員等方面具有潛在的應用前景。