晏繼喜，查淑娟，談 歡

（1.武漢市武昌醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢430063；2.湖北省腫瘤醫(yī)院，湖北 武漢 430079）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是全球終末期腎疾病的首要原因，也是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一［1］。高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡進(jìn)而引起系膜細(xì)胞缺失是導(dǎo)致DN患者出現(xiàn)腎損傷的主要機(jī)制［2］。同時(shí)高糖引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加在DN的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，高糖可通過(guò)誘導(dǎo)ROS生成促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞凋亡［3］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療領(lǐng)域［4］。己酮可可堿（pentoxifylline，PTX）是一種甲基黃嘌呤衍生物，具有免疫抑制以及抗纖維化的作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，PTX可顯著減少DN患者的尿蛋白并改善腎功能［6］。但PTX聯(lián)合MSC對(duì)DN的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究采用體外高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，將MSC和高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)后，探討不同濃度PTX對(duì)共培養(yǎng)后腎小球系膜細(xì)胞ROS信號(hào)及細(xì)胞凋亡的影響，為PTX和MSC協(xié)助治療DN提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

DMEM-LG（美國(guó)Hyclone）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰蛋白酶、Percoll分離液、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、PBST、MTT溶液、抗熒光淬滅封片液（含DAPI）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、大鼠 ROS 試劑盒和辣根過(guò)氧化標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（武漢Bioswamp）；APC-抗小鼠CD30抗體（美國(guó)Biolegend）；APC-抗小鼠CD90抗體和APC抗小鼠CD105抗體（美國(guó)eBioscience）；胎牛血清和BSA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國(guó)Gibco）；兔抗小鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、兔抗小鼠nephrin、兔抗小鼠Bcl-2、兔抗小鼠Bax、兔抗小鼠胱天蛋白酶3、兔抗小鼠胱天蛋白酶8和兔抗小鼠胱天蛋白酶9多克隆抗體（英國(guó)Adcam）；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD）；PVDF轉(zhuǎn)移膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Millipore）。

1.2 小鼠骨髓MSC的分離與鑒定［7］

6周齡清潔型C57BL/6小鼠（湖北省疾控中心），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：No.42000600030281。將小鼠頸椎脫臼處死后，75%乙醇浸泡消毒10 min。然后將股骨和脛骨兩端剪斷，暴露骨髓腔，并用注射器抽取無(wú)血清的DMEM-LG培養(yǎng)液沖洗出骨髓，再利用200目網(wǎng)篩過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液。加入等體積密度為1.073 kg·L-1的Percoll分離液離心分離出MSC細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM-LG完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般以1∶2或1∶3傳代。

1.3 熒光顯微鏡鑒定腎小球系膜細(xì)胞

每日在倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性。根據(jù)曹英杰等［7］方法分離并培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，然后進(jìn)行免疫熒光鑒定。取生長(zhǎng)狀況良好的腎小球系膜細(xì)胞，PBS清洗后用甲醛固定10 min。再用PBS清洗，加透膜液室溫通透20 min，然后用10%BSA封閉10 min。加一抗（抗α-SMA抗體，稀釋比例1∶50；抗nephrin抗體，稀釋比例1∶100），4℃孵育過(guò)夜；加二抗（1∶200），37℃孵育1 h。PBS清洗后加入含DAPI的抗熒光淬滅封片液，在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 MTT法確定PTX實(shí)驗(yàn)用濃度

分別將腎小球系膜細(xì)胞和MSC細(xì)胞以每孔1×104接種于96孔板上，37℃培養(yǎng)48 h。PTX 0.1，0.3和 1.0 mmol·L-1處理細(xì)胞 48 h 后，每孔加 20 μL MTT 5 g·L-1溶液，培養(yǎng)4 h。最后加200 μL DMSO溶解液，混勻后于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值（A490nm）。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A490nm-空白組A490nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A490nm-空白組A490nm）×100%。

1.5 高糖模型建立和細(xì)胞分組處理

利用葡萄糖30 mmol·L-1刺激系膜細(xì)胞12 h后，將其分為：高糖組，MSC組（高糖系膜細(xì)胞與MSC按1∶10共培養(yǎng)），MSC+PTX 0.1，0.3和1 mmol·L-1組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h檢測(cè)各指標(biāo)，另設(shè)置對(duì)照組，采用低濃度（5.6 mmol·L-1）葡萄糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞。

1.6 MTT檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞存活

取1.5分組處理后的系膜細(xì)胞，將各組的系膜細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為每孔5×103，每組每個(gè)時(shí)段設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。然后每孔加20 μL MTT溶液（5 g·L-1），室溫孵育 4 h 后每孔再加 150 μL DMSO，避光混勻后檢測(cè)A490nm。細(xì)胞存活率（%）=（加藥組A490nm/細(xì)胞對(duì)照A490nm）×100%。

1.7 ELlSA檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞SOD活性、MDA和ROS含量

收集按1.5實(shí)驗(yàn)分組處理后的系膜細(xì)胞，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，在酶標(biāo)儀下讀取吸光度值，測(cè)定系膜細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA和ROS的含量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞凋亡率

取1.5分組處理的細(xì)胞，胰蛋白酶消化系膜細(xì)胞并用PBS清洗2次。1000×g離心3 min，去上清，然后用PBS重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)。取1×106個(gè)細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，然后加5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，混勻后于4℃中避光孵育30 min。最后加300 μL結(jié)合緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 Western印跡法檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9蛋白表達(dá)水平

取各組系膜細(xì)胞，加入蛋白酶和裂解液提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗（Bcl-2稀釋比1∶2000；Bax稀釋比1∶1000；胱天蛋白酶3稀釋比1∶500；胱天蛋白酶8稀釋比1∶2000；胱天蛋白酶9稀釋比 1∶2000），室溫孵育 1 h。PBST 洗膜后，加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋比1∶10 000）室溫孵育1 h。PBST清洗后，將膜置于暗室中并加ECL試劑，以GAPDH為內(nèi)參，在化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MSC形態(tài)觀察及鑒定

顯微鏡下觀察第3代MSC形態(tài)（圖1A），細(xì)胞出現(xiàn)渦旋狀融合生長(zhǎng)，并呈紡錘狀。對(duì)MSC細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105和CD90進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)CD105和CD90均高表達(dá)，表達(dá)率分別為96.06%和91.97%；CD30低表達(dá)，表達(dá)率為0.20%（圖1B），符合MSC特征。MSC純度＞95%。

Fig.1 Morphological observation（A）by fluorescence microscope and identification of CD105，CD90 and CD30 in mesenchymal stem cells（MSCs）by flow cytometry（B）.

2.2 腎小球系膜細(xì)胞鑒定

免疫熒光染色結(jié)果（圖2）所示，系膜標(biāo)志物α-SMA抗體染色陽(yáng)性，藍(lán)色顯示為細(xì)胞核，綠色顯示為標(biāo)志物α-SMA染色；nephrin抗體染色陰性，細(xì)胞純度＞95%。

2.3 PTX實(shí)驗(yàn)濃度

MTT結(jié)果顯示，PTX 1.0 mmol·L-1處理MSC細(xì)胞后，MSC細(xì)胞存活率為（73.5±0.7）%，腎小球系膜細(xì)胞存活率為（74.9±0.7）%。結(jié)果顯示，該濃度下的PTX毒性作用較小，為避免其對(duì)細(xì)胞的毒性影響，本研究使用PTX≤1 mmol·L-1濃度干預(yù)細(xì)胞。

2.4 PTX聯(lián)合MSC對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞存活的影響

如表1所示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，高糖刺激后細(xì)胞存活率均明顯降低（P＜0.01）；與高糖組比較，MSC組、高糖+MSC+PTX 0.1，0.3 和1.0 mmol·L-1組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.01）。與高糖+MSC組比較，高糖+MSC+PTX 0.1，0.3 和1.0 mmol·L-1組存活率顯著升高（P＜0.01）。

Fig.2 ldentification of glomerular mesangial cells by immunohistochemistry.Green shows marker α-smooth muscle actin（α-SMA）staining.

Tab.1 Effect of pentoxifylline（PTX）combined with MSCs on survival of glomerular mesangial cells induced by high glucose

2.5 PTX聯(lián)合MSC對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA和ROS含量的影響

如表2所示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，高糖組腎小球系膜細(xì)胞SOD含量顯著降低（P＜0.01），MDA和ROS含量顯著升高（P＜0.01）。與高糖組相比，高糖+MSC組和MSC+PTX組腎小球系膜細(xì)胞SOD活性顯著升高（P＜0.01），MDA和ROS含量顯著降低（P＜0.01），其中MSC+PTX 1.0 mmol·L-1組效果最明顯。與高糖+MSC組比較，PTX干預(yù)后腎小球系膜細(xì)胞SOD活性顯著升高（P＜0.01），MDA和ROS含量顯著降低（P＜0.01）。

2.6 PTX聯(lián)合MSC對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，高糖組、高糖+MSC組和高糖+MSC+PTX組腎小球系膜細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01）。與高糖組比較，高糖+MSC組及高糖+MSC+各濃度PTX組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.01），且隨干預(yù)的PTX濃度升高，凋亡抑制效果越明顯。

2.7 PTX聯(lián)合MSC對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖4），與細(xì)胞對(duì)照組比較，高糖組的Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與高糖組相比，高糖+MSC組和高糖+MSC+PTX組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與MSC組比較，不同濃度PTX干預(yù)后，腎小球系膜細(xì)胞Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸下降（P＜0.05或P＜0.01）。

Fig.3 Effect of PTX combined with MSCs on high glucose-induced apoptosis of glomerular mesangial cells（A，B）of mice.See Tal.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01 ，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with high glucose group；△△P＜0.01，compared with high glucose+MSC group.

Tab.2 Effect of PTX combined with MSCs on superoxide dismutase（SOD）activity，malondialdehyde（MDA）and reactive oxygen species（ROS）content in glomerular mesangial cells induced by high glucose

Fig.4 Effect of PTX combined with MSCs on expressions of apoptosis-related molecules in glomerular mesangial cells induced by high glucose.See Tab.1 for the cell treatment.1：cell control；2：high glucose；3：high glucose+MSCs；4：high glucose+MSCs+PTX 0.1 mmol·L-1；5：high glucose+MSCs+PTX 0.3 mmol·L-1；6：high glucose+MSCs+PTX 1.0 mmol·L-1.B-F were the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with high glucose group；△△P＜0.01，compared with high glucose+MSCs group.

3 討論

DN是一種常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥，其特點(diǎn)是過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積聚于腎小管基底膜和腎小球?qū)е孪的せ|(zhì)增生，最終進(jìn)展為腎小管間充質(zhì)纖維化以及腎小球硬化［8］。已有研究表明，高糖誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡引起系膜細(xì)胞缺失是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的主要機(jī)制［9-10］。

本研究結(jié)果顯示，PTX聯(lián)合MSC可通過(guò)減少腎小球系膜細(xì)胞凋亡抑制DN的進(jìn)展。

腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的固有細(xì)胞之一，系膜細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，腎小球系膜細(xì)胞凋亡數(shù)與DN患者蛋白尿的程度密切相關(guān)［11］。PTX屬于非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，曾被用于治療血管性疾病。近年研究表明，PTX可減輕DN的腎損害，改善腎功能，這種作用可能與其降低全身和腎組織局部氧化應(yīng)激水平有關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，MSC和MSC+PTX可升高高糖導(dǎo)致的系膜細(xì)胞SOD活性降低及MDA和ROS含量升高。高糖體外培養(yǎng)系膜細(xì)胞可顯著誘導(dǎo)其凋亡，ROS過(guò)量生成是各種途徑的共同特征，也是高血糖損傷機(jī)制的核心［13］。SOD廣泛存在于生物體細(xì)胞內(nèi)，是清除自由基的首要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者體內(nèi)SOD活性降低［14］。姜林等［15］研究表明，高糖刺激可引起系膜細(xì)胞SOD活性降低，MDA和ROS含量升高，但脂聯(lián)素可升高系膜細(xì)胞SOD含量，降低MDA和ROS含量，即脂聯(lián)素對(duì)高糖引起的系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示，PTX聯(lián)合MSC能保護(hù)系膜細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，與上述研究中脂聯(lián)素對(duì)系膜細(xì)胞的作用一致。本研究結(jié)果表明，MSC或MSC+PTX可降低高糖導(dǎo)致的腎小球系膜細(xì)胞凋亡，下調(diào)胱天蛋白酶的表達(dá)，且MSC+PTX聯(lián)合效果顯著強(qiáng)于MSC。李小會(huì)等［16］發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)益腎方可抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)胱天蛋白酶12的表達(dá)有關(guān)。本研究提示，PTX聯(lián)合MSC能抑制高糖導(dǎo)致的腎小球系膜細(xì)胞凋亡并下調(diào)凋亡蛋白的表達(dá)。

綜上所述，不同濃度的PTX聯(lián)合MSC可通過(guò)減少腎小球系膜細(xì)胞凋亡以及抑制其氧化應(yīng)激來(lái)抑制DN的進(jìn)展。