武偉男，許小斌，連世忠

基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化可以關(guān)閉某些基因尤其是抑癌基因的活性，導(dǎo)致基因表達(dá)受限，表達(dá)量降低，從而影響細(xì)胞的增殖[1-3]。一些研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-147(miR-147)在肺癌、卵巢癌等腫瘤組織中可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，起抑癌基因的作用[4-6]。而目前及既往研究中并未提及miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化在膠質(zhì)瘤研究中的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞模擬人體膠質(zhì)瘤組織，探究U87細(xì)胞中miR-147基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與miR-147表達(dá)量及細(xì)胞增殖的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的診斷以及治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 U87細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心)；DMEE高糖培養(yǎng)基、無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液等；雙抗；潔凈工作臺(tái)(江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠)；低速低溫離心機(jī)、移液器(Eppendorf)；PCR儀、測(cè)序儀(美國ABI)；電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠)；冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；凝膠成像儀微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(太倉市科教器材廠)；BP系列精密單道可調(diào)移液器(加拿大BBI)；UV-Vis Spectrophotometer(Merinton)；冰箱(青島海爾股份有限公司)。其余試劑以及所用儀器均購置于上海生工股份有限公司。

1.2 配制不同濃度5′aza-dC DMEM高糖培養(yǎng)基 首先配制成濃度為1 mmol/L的儲(chǔ)存濃度，然后分別用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，稀釋后使其濃度分別為4 μmol/L、16 μmol/L備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基組成：DMEM、PBS以及雙抗；培養(yǎng)條件：5%二氧化碳(CO2) 、37 ℃溫培養(yǎng)箱。設(shè)置空白組與實(shí)驗(yàn)組，空白組用一般高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別使用不同濃度5′aza-dC DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，并作為4 μmol/L組、16 μmol/L組，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)過程中注意無菌操作，并且及時(shí)換液以保證細(xì)胞活性。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 使用BSP法檢測(cè)U87細(xì)胞中miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，使用Ezup 柱式動(dòng)物組織基因組DNA抽屜試劑盒提取各組細(xì)胞中的目的DNA，對(duì)提取的DNA使用亞硫酸氫鈉修飾。BSP引物序列如下：上游引物序列為5′-ATAGTGGTGTAATTTTGGTTTATTG-3′，下游引物序列為3′ -CCCAACACTTTAAAAAACTAAAAC-5′，擴(kuò)增序列為198bp(包括引物序列)。本次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系：總體積為64 μL，其中cDNA 1.5 μL，上下游引物各2 μL，dNTP(mix) 3 μL，Taq Buffer (with MgCl2) 5 μL，Taq酶 0.5 μL，dd H2O 50 μL。本次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃～60 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 6 min。PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行電泳，即1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖觀察結(jié)果。亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序所得圖譜使用Chromas軟件進(jìn)行分析。各組中每個(gè)位點(diǎn)做5次克隆，重復(fù)2次，共10次克隆，記錄每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生甲基化的情況，計(jì)算各位點(diǎn)的甲基化率及各組總甲基化率。

1.4.2 QPCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-147表達(dá)量 繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-147表達(dá)量。首先通過Trizol試劑提取總RNA，然后在反轉(zhuǎn)錄試劑引導(dǎo)下進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，最后以單鏈cDNA 為PCR模板 ，在對(duì)應(yīng)引物的引導(dǎo)下，以U6為內(nèi)參，進(jìn)行miR-147表達(dá)量的QPCR檢測(cè)。檢測(cè)引物序列miR-147-上游：5′-GGGGTGTGTGGAAAT-3′和miR-147-下游：3′ -AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-5′，U6-上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和U6-下游：3′ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。反應(yīng)程序：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s；39 cycles；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。miR-147的表達(dá)量采用Ct比較法進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)復(fù)孔檢測(cè)3次。

1.4.3 觀察細(xì)胞數(shù)目及受抑制程度 顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞數(shù)目并計(jì)算細(xì)胞受抑制程度，細(xì)胞受抑制程度=[(空白組細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù))/空白組細(xì)胞數(shù)]×100%。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因序列與亞硫酸氫鹽修飾后模式序列(見圖1) 亞硫酸氫鈉處理后模式序列：所有C轉(zhuǎn)為T，CG位點(diǎn)仍然為C。方框內(nèi)為設(shè)計(jì)引物的位置。該基因片段共有9個(gè)CG位點(diǎn)(見圖1中紅色標(biāo)記)。將這些位點(diǎn)分別記作1～9。

圖1 目的基因序列與亞硫酸氫鹽修飾后模式序列(A為目的基因序列；B為修飾后模式序列)

2.2 各組電泳結(jié)果(見圖2) 以下結(jié)果是取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳參數(shù)：150 V，100 mA所得的DNA Marker，分別是空白組(0 μmol/L)、4 μmol/L組以及16 μmo/L組，每條條帶的核苷酸序列長(zhǎng)度約為198 bp。

2.3 測(cè)序結(jié)果(見圖3) 發(fā)生甲基化的CG位點(diǎn)保持不變，未發(fā)生甲基化的CG位點(diǎn)C堿基則變?yōu)門堿基。

圖2 各組電泳結(jié)果

圖3 測(cè)序結(jié)果

2.4 測(cè)序后各組miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化率(見圖4) 空白組各位點(diǎn)甲基化率分別為100%、40%、40%、20%、60%；4 μmol/L組各位點(diǎn)甲基化率分別為100%、40%、20%；16 μmol/L組各位點(diǎn)甲基化率分別為40%、20%。計(jì)算總甲基化率：空白組為14.6%，4 μmol/L組為8.9%，16 μmol/L組為3.4%。

圖4 測(cè)序后各組miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化率(A為空白組；B為4 μmol/L組；C為16 μmol/L組)

2.5 不同組中miR-147表達(dá)量比較及細(xì)胞抑制率(見圖5、圖6) 空白組miR-147相對(duì)表達(dá)量為0.29±0.02，4 μmol/L組miR-147相對(duì)表達(dá)量為0.66±0.03，16 μmol/L組miR-147相對(duì)表達(dá)量為1.09±0.05。組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。4 μmol/L組大約有19.4%細(xì)胞受抑制，16 μmol/L組大約有51.6%細(xì)胞受抑制。

圖5 各組中miR-147相對(duì)表達(dá)量

圖6 各組培養(yǎng)72 h后細(xì)胞數(shù)目切片圖

3 討 論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科常見的一類腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中占比非常高，其發(fā)生率占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[7-9]，其治療相當(dāng)困難，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[10]，即使積極通過手術(shù)、放化療等措施，其生存周期也往往不足1年。而臨床治療膠質(zhì)瘤的化療藥物主要是去甲基化藥物替莫唑胺[11-13]，其主要作用為抑制MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度。但是有些膠質(zhì)瘤已經(jīng)對(duì)替莫唑胺的去甲基化作用產(chǎn)生耐藥性[14-16]。所以，需要尋找更為合適的方法來攻克這一難題，目前，研究基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是一個(gè)比較熱門的方向。

基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化廣泛存在于包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)[17]，尤其與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[18-19]。研究基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化主要是研究啟動(dòng)子區(qū)的CpG島中CG位點(diǎn)的甲基化情況，如果CpG島中甲基化程度過高，則會(huì)抑制該基因的表達(dá)，相反，如果降低啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度，則會(huì)使該基因表達(dá)恢復(fù)，這就是DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化的“開關(guān)”現(xiàn)象[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過使用不同濃度的甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′aza-dC培養(yǎng)基培養(yǎng)U87細(xì)胞，使該細(xì)胞中miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平發(fā)生不同程度的降低，并且檢測(cè)各組中miR-147的表達(dá)量及細(xì)胞抑制率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)降低U87細(xì)胞中miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度后會(huì)使miR-147的表達(dá)量增多，并且能夠抑制細(xì)胞增殖。因此，這可能為去甲基化藥物的研究提供一個(gè)新的作用位點(diǎn)，通過降低miR-147啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度來達(dá)到治療膠質(zhì)瘤的目的，當(dāng)然，這確切機(jī)制仍需要在人腦膠質(zhì)瘤組織以及其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中做進(jìn)一步的研究，并進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。