姜海濤，代玉靜，魏 瑋，孫顯東，徐艷慧，李 強(qiáng)，楊華志，斯欽孟和，王衛(wèi)芳

高血壓是多種心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族居民的高血壓患病率較同地區(qū)的漢族居民高，可能與兩個(gè)民族居民的飲食、生活習(xí)慣差異有關(guān)，但具體的生物學(xué)機(jī)制尚不清楚[2]。微小RAN(microRNA，miRNA)屬調(diào)控性非編碼RNA，為一類由內(nèi)源基因編碼單鏈RNA分子，其長(zhǎng)度約為19～23個(gè)核苷酸，可參與動(dòng)植物生命活動(dòng)中轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，高血壓的發(fā)生與miRNA的調(diào)控有密切關(guān)系[3]。而內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族居民與同地區(qū)的漢族高血壓病人血管內(nèi)皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜是否存在差異報(bào)道較少。本研究旨在通過(guò)比較內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族和漢族高血壓病人血管內(nèi)皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜，探討兩個(gè)民族居民高血壓發(fā)病率差異的生物學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2017年9月—2018年9月赤峰市醫(yī)院、錫林郭勒盟醫(yī)院、海拉爾區(qū)人民醫(yī)院就診的128例蒙古族原發(fā)性高血壓病人作為觀察組，其中男74例，女54例；將136例漢族原發(fā)性高血壓病人作為對(duì)照組，其中男76例，女60例。研究對(duì)象的血壓依據(jù)《中國(guó)高血壓防治指南2010》所制定的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量，以兩次測(cè)量結(jié)果的平均值作為最后的血壓值。其中高血壓診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：在未用抗高血壓藥情況下，收縮壓(SBP)≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg，或既往有高血壓史，目前正在用抗高血壓藥者，即診斷為高血壓[4]。正常血壓高值：SBP 120～139 mmHg和(或)DBP 80～89 mmHg；1級(jí)高血壓：SBP 140～159 mmHg和(或)DBP 90～99 mmHg；2級(jí)高血壓：SBP 160～179 mmHg和(或)DBP 100～109 mmHg；3級(jí)高血壓：SBP≥180 mmHg和(或)DBP≥110 mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓、心功能Ⅲ～Ⅳ級(jí)、冠心病、重度肺功能不全、風(fēng)濕性疾病、糖尿病、內(nèi)分泌紊亂、嚴(yán)重肝腎功能異常、腦卒中、外周動(dòng)脈疾病、精神疾病以及妊娠或哺乳期女性。研究對(duì)象均簽訂知情同意書。

1.2 質(zhì)量控制 依據(jù)《中國(guó)高血壓基層管理指南(2014年修訂版)》的方法對(duì)項(xiàng)目組成員進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查和血壓測(cè)量操作的專項(xiàng)培訓(xùn)，并設(shè)專人對(duì)樣本收集過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行雙錄入，兩次錄入結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)檢錯(cuò)，錄入正確率為99.9%。

1.3 方法

1.3.1 外周血總RNA提取和質(zhì)量檢測(cè) 兩組病人均于清晨抽取空腹外周靜脈血(10 mL)，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。?50 μL血液加750 μL Trizol RNA提取液的比例混合，裂解5 min后，加入200 μL氯仿，室溫靜置3 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入500 μL異丙醇，靜置過(guò)夜后(-20 ℃)、4 ℃、12 000 r/min離心15 min；棄上清，用80%的焦碳酸二乙酯(DEPC)乙醇洗滌總RNA，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，自然風(fēng)干RNA沉淀。加雙蒸水溶解總RNA，采用NanoDrop風(fēng)光光度計(jì)和Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)檢測(cè)樣品總RNA的A260/A280值，介于1.7～2.2且28S/18S>0.7，表明總RNA樣品的質(zhì)量合格。液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 miRNA反轉(zhuǎn)錄 利用TaqMan MIRNA Reverse Transeription Kit和帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNAs特異RT-primer進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄。miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA采用miRNA熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行 RNA定量，miRNAs反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為15 μL：dNTPs(100 mmol/L)0.15 μL、反轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)1 μL、10×Buffer 1.5 μL、酶抑制劑(20 U/μL)0.019 L，無(wú) RNA 酶純水 4.16 μL，每15 μL RT reaction體系包含7 μL RT master mix、5 μL total RNA (1 to 10 ng per reaction)，離心后置于冰上孵育 5 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃保存。 miRNA的定量檢測(cè)：利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法，定量檢測(cè)血漿中miRNAs表達(dá)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40個(gè)循環(huán)，組內(nèi)重復(fù)3次取平均值。通過(guò)優(yōu)化提取、反轉(zhuǎn)錄及定量檢測(cè)方法，建立穩(wěn)定、可靠的血漿miRNAs定量檢測(cè)方法。

1.3.3 基因芯片檢測(cè)不同樣品中miRNA表達(dá)譜差異 總RNA進(jìn)行Poly(A)加尾，根據(jù)生物標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書，將生物素標(biāo)記的信號(hào)分子與總RNA相連接。在室溫條件下，取雜交液81.7 μL與經(jīng)生物素標(biāo)記的總RNA樣品混勻，并按說(shuō)明書進(jìn)行處理后，加入miRNA芯片中，于雜交爐內(nèi)恒溫(48 ℃)雜交16 h。結(jié)束后棄雜交液，芯片加入緩沖液沖洗，待芯片干燥后進(jìn)行掃描。掃描圖像經(jīng)Affymetrix GeneChip Command Consolies 1.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，篩選兩組芯片中與高血壓相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：Cy3、Cy5信號(hào)值均>200，Cy3或Cy5信號(hào)值>800，差異倍數(shù)在2倍以上，且P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組年齡、性別、血脂指標(biāo)、肌酸(Cr)、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、2型糖尿病、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)等臨床資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 miRNA濃度及純度的檢測(cè) 蒙古族和漢族高血壓病人血液總RNA的A260/A280值分別為2.24和2.31，總RNA的濃度分別為287 ng/μL和296.9 ng/μL，28S/18S比值分別為1.69和1.81。表明上述樣品所提取總RNA的質(zhì)量符合芯片檢測(cè)要求，可以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

2.3 兩組樣本表達(dá)譜miRNA基因芯片結(jié)果 miRNA基因芯片共檢測(cè)2 812個(gè)miRNA。觀察組與對(duì)照組相比，篩選獲得20個(gè)差異表達(dá)較劇烈的miRNA，其中上調(diào)表達(dá)12個(gè)，下調(diào)表達(dá)8個(gè)。上調(diào)表達(dá)的miRNA多于下調(diào)表達(dá)的miRNA 。詳見表2、表3。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄cDNA質(zhì)量的檢測(cè) cDNA定量：取混勻的cDNA樣本1 μL，用分光光度儀分別測(cè)定260 nm、280 nm的吸光值。根據(jù)A260/A280估計(jì)核酸純度及濃度，均符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 兩組miRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 提取兩組血漿中的RNA，運(yùn)用hsa-miR-132、hsa-miR-192、hsa-miR-212、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-17、hsa-miR-30、hsa-miR-72、hsa-miR-144、hsa-miR-150、hsa-miR-638、hsa-miR-1249、hsa-miR-185和hsa-miR-155、hsa-miR-27b、hsa-miR-149、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-1825、hsa-miR-1280、hsa-miR-150分子末端加 poly(A)尾法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再用 SYBRGreen法進(jìn)行qRT-PCR，核小分子RNA U6(RNU6)作為內(nèi)參。計(jì)算2-△△T后，通過(guò)兩組比較t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.6 兩組血液miRNA表達(dá)譜差異檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)基因芯片檢測(cè)，與漢族高血壓病人相比，蒙古族高血壓病人血液中，上調(diào)的與高血壓相關(guān)的miRNAs有12個(gè)，其中miRNA-132上調(diào)倍數(shù)最大(29.33倍)，詳見表2；而下調(diào)的與高血壓相關(guān)的miRNAs有8個(gè)，miRNA-155下調(diào)倍數(shù)最大(14.12倍)，詳見表3。分別對(duì)上述差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，結(jié)果顯示，上述miRNA主要參與凋亡信號(hào)通路(主要為p53)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞骨架信號(hào)通路等。

表2 兩組血液miRNA表達(dá)譜差異檢測(cè)結(jié)果(上調(diào)倍數(shù))

表3 兩組血液miRNA表達(dá)譜差異檢測(cè)結(jié)果(下調(diào)倍數(shù))

2.7 高血壓不同亞組miRNA表達(dá)水平比較 高血壓病人分為3個(gè)亞組：1級(jí)高血壓組、2級(jí)高血壓組、3級(jí)高血壓組，3組年齡、高血脂史、糖尿病史、高血壓史、冠心病家族史、BMI、TC、TG、HDL-C、載脂蛋白A1(Apo-A1)、血同型半胱氨酸(Hcy)、血清總膽紅素(TBIL)、纖維蛋白原(FIB)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3級(jí)高血壓組miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)高于2級(jí)高血壓組，2級(jí)高血壓組高于1級(jí)高血壓組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，miRNA-132、miRNA-192、miRNA-212、miRNA-361-5p、miRNA-17、miRNA-155、miRNA-27b的特異度和敏感度較高，可作為蒙古族高血壓病人與漢族高血壓病人差異的標(biāo)記物。

3 討 論

miRNA的生物學(xué)作用機(jī)制一般為與靶mRNA的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合后，可以負(fù)性調(diào)控靶mRNA的翻譯水平(或者直接將靶mRNA降解)，從而負(fù)性調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。一般情況下，一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因又可以受到多個(gè)miRNA的負(fù)性調(diào)控，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明，高血壓的發(fā)病具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的功能、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的功能及其細(xì)胞膜電離子通道的數(shù)量及功能等，并且上述各靶點(diǎn)均可與有相關(guān)的miRNA參與調(diào)控[6-9]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體的組織和細(xì)胞產(chǎn)生的miRNAs在參與高血壓的發(fā)病過(guò)程中，可以進(jìn)入血液循環(huán)，并在血液中被檢測(cè)到。由于這些miRNAs均以某種穩(wěn)定的形式存在，從而不會(huì)被血液中的RNA酶所降解。因此，這些參與高血壓發(fā)病的miRNAs不僅可以作為早期診斷高血壓病的生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)也可以作為治療高血壓病的靶點(diǎn)[10]。

miRNA芯片檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)計(jì)算機(jī)掃描處理和定量分析芯片的高密度雜交點(diǎn)陣圖象，從而得到miRNA差異表達(dá)譜，具有高通量、高靈敏性、高度可重復(fù)性以及生物檢材需求量低等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于包括高血壓病在內(nèi)的多種疾病發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)的研究中。本研究借助miRNA芯片檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，成功篩查出內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族高血壓病人和漢族高血壓病人差異表達(dá)的高血壓病相關(guān)miRNA 20個(gè)。蒙古族高血壓病人血液中hsa-miR-132、hsa-miR-192、hsa-miR-212、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-17、hsa-miR-30、hsa-miR-72、hsa-miR-144、hsa-miR-150、hsa-miR-638、hsa-miR-1249和hsa-miR-185表達(dá)上調(diào)，hsa-miR-155、hsa-miR-27b、hsa-miR-149、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-1825、hsa-miR-1280、hsa-miR-150表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)量與高血壓分級(jí)有關(guān)，即分級(jí)越高，上調(diào)或下調(diào)越大，3級(jí)高血壓最明顯。根據(jù)對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族居民和漢族居民的高血壓患病率差異可能與凋亡信號(hào)通路(主要為p53)、TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞骨架信號(hào)通路等有關(guān)。表明由于受到遺傳因素以及飲食因素的影響，上述20個(gè)miRNAs在內(nèi)蒙古地區(qū)的蒙古族居民和漢族居民體內(nèi)存在差異表達(dá)，從而造成包括凋亡信號(hào)通路(主要為p53)、TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物活性在兩個(gè)民族的居民體內(nèi)存在差異，而這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均與高血壓的發(fā)病存在密切相關(guān)關(guān)系，從而導(dǎo)致同一地區(qū)兩個(gè)民族的居民在高血壓病的發(fā)病比例上存在明顯差異[2，5]。

本研究結(jié)果提示，上述20個(gè)miRNAs在內(nèi)蒙古地區(qū)的蒙古族居民和漢族居民體內(nèi)存在差異表達(dá)，并參與差異調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，最終導(dǎo)致同一地區(qū)兩個(gè)民族的居民高血壓發(fā)病率存在明顯差異。因此，上述20個(gè)miRNAs有可能作為早期診斷內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族居民高血壓病的生物學(xué)指標(biāo)。但至于上述哪些miRNAs可以作為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族居民高血壓病治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，還有待于進(jìn)一步研究。