王紫君,任紅艷,肖紅衛(wèi),華再東,畢延震

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064)

CRISPR/Cas體系最初在細(xì)菌體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡(jiǎn)稱,Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡(jiǎn)稱。CRIPSR/Cas體系普遍存在于細(xì)菌中,它是由RNA介導(dǎo)的可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng),可使細(xì)菌高效辨認(rèn)和切割入侵的外源核酸[1]。CRISPR系統(tǒng)可分為6種類型,其中Ⅱ型系統(tǒng)僅需要1種Cas蛋白即可對(duì)外源核酸進(jìn)行更高效、特異的切割,因此成為基因編輯工具的最佳選擇[2-3]。CRISPR/Cas技術(shù)作為第三代基因組編輯技術(shù)在近年迅速發(fā)展起來,目前該技術(shù)被成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠、猴、豬、山羊等的基因組精確修飾[4-9]；通過對(duì)基因的修復(fù)機(jī)制包括非同源末端連接修復(fù)、同源重組修復(fù)等,由于CRISPR/Cas突變效率高、制作簡(jiǎn)單及成本低的特點(diǎn),被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造工具[10]。

生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SST)是一種生長(zhǎng)抑制激素,最初由Brazen等于1973年從動(dòng)物下丘腦中發(fā)現(xiàn)[11],主要有14和28個(gè)氨基酸兩種活性形式,目前在豬、綿羊、大鼠、小鼠、牛等許多種屬動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種SST樣的肽。研究發(fā)現(xiàn),SST廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道內(nèi),還存在于人甲狀腺的濾泡旁細(xì)胞、胎盤和腎臟、腎上腺髓質(zhì)等部位。SST作用的發(fā)揮是通過膜上生長(zhǎng)抑素受體(SSTR)介導(dǎo),SSTR通過G蛋白與腺苷酸環(huán)化酶、鉀離子通道、鈣離子通道相偶聯(lián),作用于細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的效應(yīng)系統(tǒng)。SST通過抑制生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素、胰島素、胰高血糖素、胃泌素和膽囊收縮素等的合成或作用效能,影響消化功能,抑制消化系統(tǒng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,從而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)[12]。

本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)敲除豬的SST基因,為在細(xì)胞水平、胚胎水平研究SST基因提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬成纖維細(xì)胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物胚胎工程與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;載體質(zhì)粒為pSpCas9(BB)-2A-Puro;感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室有限公司。

1.2 主要試劑

FBS; DMEM basic(1×)、DPBS basic(1×)、Genomic DNA Mini Kit、Agarose購(gòu)自Thermo Fisher Scientific;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; pMDTM18-T Vector Cloning Kit、Premix Taq購(gòu)自Takara;除特別說明,其他試劑均購(gòu)自Sigma公司;本實(shí)驗(yàn)所有引物均由生工武漢合成部合成。

1.3 用貼壁法分離豬腎的成纖維細(xì)胞

取1頭新生1～3 d的雄性大白豬,經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg)深度麻醉;用75%酒精充分清洗消毒大白豬的體表,然后用滅菌醫(yī)用手術(shù)器械無(wú)菌操作取出雙側(cè)腎臟,置于75%酒精中浸泡并移至超凈工作臺(tái)內(nèi)。

用含2%抗生素(青霉素132 mg/L、鏈霉素200 mg/L)的DPBS反復(fù)清洗腎臟,然后用手術(shù)剪仔細(xì)剝離腎臟包膜,再用75%酒精浸泡大約30 s以充分消毒避免污染。用DPBS清洗2次后將腎臟組織放入直徑為60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,用眼科剪將其剪成大小約為 1 mm3的小塊組織。

將小塊組織分散到六孔板中,每孔約9塊組織,并盡量吸干組織周圍的液體。在恒溫培養(yǎng)箱中倒置4 h；待組織塊與培養(yǎng)皿底部緊密粘連時(shí),取出加入500 μL培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含15%血清和1%雙抗。在39 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)24 h后,加入2 mL完全培養(yǎng)基。每天觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài),根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行換液,預(yù)防細(xì)胞受到污染。

1.4 豬SST基因sgRNA的設(shè)計(jì)

選定豬SST基因(GenBank登陸號(hào): NC_010455.5)的第一外顯子為打靶區(qū)域,利用網(wǎng)站(http://crispor.tefor.net)對(duì)打靶區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA,設(shè)計(jì)條件為: sgRNA的長(zhǎng)度為20 nt,核心序列為NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(20)-NGG;在正義鏈模板的5’端添加CACCG,在反義鏈模板的5’端添加AAAC,使寡核苷酸鏈與載體質(zhì)粒黏性末端互補(bǔ)。最終選擇兩個(gè)合適的靶點(diǎn),命名為E1-1和E1-2。核酸序列見表1。

表1 sgRNA靶點(diǎn)的寡核苷酸序列

1.5 豬SST基因編輯載體的構(gòu)建

以pSpCas9(BB)-2A-Puro(簡(jiǎn)稱PX459)為載體質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體,載體質(zhì)粒的信息見圖1。將E1-1和E1-2分別連接到PX459上,分別命名為PX459-E1-1、PX459-E1-2。載體構(gòu)建具體步驟為:將公司合成的每對(duì)寡核苷酸稀釋至10 μmol/L,按16 μL ddH2O、2 μL 10×NEB Buffer 3、1 μL正義鏈和1 μL反義鏈的配比混合:混勻后在95 ℃下反應(yīng)5 min,之后在室溫下自然退火;將寡核苷酸雙鏈插入到線性化的PX459,將1 μL線性化的PX459、3 μL退火產(chǎn)物、5 μL SolutionⅠ混合,加ddH2O至10 μL,然后在37 ℃下連接2 h;轉(zhuǎn)化:將5 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,輕彈混勻,先冰置30 min,然后在42 ℃下熱激90 s；取出后再冰置5 min,先加入1 mL無(wú)抗體的培養(yǎng)基，搖配復(fù)蘇45 min,再涂布于含氨芐抗體的平板上,挑取單克隆繼續(xù)培養(yǎng),提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證,并通過公司測(cè)序檢測(cè)是否連接正確,測(cè)序引物為通用引物U6。

頂部?jī)尚袦\色序列是sgRNA替換區(qū)。圖1 質(zhì)粒構(gòu)建信息圖

1.6 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,在CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前接種1個(gè)6孔板,每孔接種細(xì)胞量為1.2×105個(gè),待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、匯合度為80%左右時(shí),用電穿孔轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染條件為：120 V/cm,脈沖時(shí)間3 ms,質(zhì)粒添加量4 mg/mL[13]。

1.7 嘌呤霉素濃度的確定

在6孔板內(nèi)以每孔106個(gè)成纖維細(xì)胞重新鋪板,培養(yǎng)24 h后,分別配制含嘌呤霉素1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 ng/μL的篩選培養(yǎng)基,進(jìn)行培養(yǎng),每2天更換新的篩選培養(yǎng)基。每天觀測(cè)存活細(xì)胞的比例,將7 d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的濃度定為最低篩選濃度。

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,重新接種細(xì)胞,使6孔板每個(gè)孔中約有10000個(gè)細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng),使細(xì)胞恢復(fù)到較好的狀態(tài)。在繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,換新的培養(yǎng)基,并加入嘌呤霉素,嘌呤霉素的濃度為最低篩選濃度。每天觀察細(xì)胞的存活狀態(tài)。在嘌呤霉素加入72 h左右后,換新的不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基,提取細(xì)胞的DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.8 單克隆細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)

待經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的單個(gè)細(xì)胞增殖為細(xì)胞團(tuán)后,在顯微鏡下觀察大小適度的細(xì)胞團(tuán),并用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿的底部標(biāo)記細(xì)胞團(tuán)的位置。移除培養(yǎng)基,用DPBS清洗兩遍。用無(wú)菌鑷子夾起一個(gè)克隆環(huán),將克隆環(huán)底部粘上無(wú)菌凡士林,輕輕地將克隆環(huán)放在一個(gè)選定的克隆之上,用鑷子稍用力均勻按壓，以克隆環(huán)能穩(wěn)定立在培養(yǎng)皿且密封為止。加50 μL 0.25%的胰酶到克隆環(huán)里,當(dāng)細(xì)胞開始變圓時(shí)加100 μL的培養(yǎng)基,吹起細(xì)胞并吸取到96孔板中,再加100 μL的培養(yǎng)基到克隆環(huán),吹吸后加到對(duì)應(yīng)的孔中。每2天換1次培養(yǎng)基,待96孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿傳代至24孔板,最后傳代至6孔板中。

1.9 單克隆細(xì)胞的基因型鑒定

分別提取未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞、單克隆擴(kuò)繁的細(xì)胞的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物在第一外顯子兩側(cè)設(shè)計(jì),序列分別為SST-E1-F:5’-ACGAGGGTAATGGTGCGTAA-3’； SST-E1-R:5’- CCTTACCTTAGCCTTGCCC-3’。PCR擴(kuò)增體系為: Premix Taq 10 μL、SST-E1-F 1 μL、SST-E1-R 1 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過90 V電壓、2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,并將單克隆細(xì)胞的PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 成纖維細(xì)胞的分離結(jié)果

經(jīng)過7 d左右的培養(yǎng),當(dāng)成纖維細(xì)胞在組織塊周圍長(zhǎng)成片并且匯合度逐漸達(dá)到90%時(shí),將組織塊挑去可獲得原代細(xì)胞。腎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好,呈梭形,在顯微鏡下觀察，其細(xì)胞透明,邊緣清晰(圖2)。在傳代后生長(zhǎng)迅速,2～3 d即可長(zhǎng)滿6孔板。轉(zhuǎn)染前1 d消化細(xì)胞傳代后,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,活力最好,轉(zhuǎn)染效果最佳。

圖2 原代成纖維細(xì)胞

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果

將E1-1、E1-2分別與線性化的PX459質(zhì)粒鏈接,然后用限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證打靶質(zhì)粒。設(shè)計(jì)用KPnⅠ+ApaⅠ雙酶切,酶切后兩條帶大小分別為2288和6886 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示片段大小與預(yù)期一致,只是質(zhì)粒濃度較高,部分未酶切。

1: E1-1; 2: E1-2。圖3 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果

將酶切驗(yàn)證后的質(zhì)粒擴(kuò)繁,提取菌液的質(zhì)粒,經(jīng)過公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)構(gòu)如圖3所示,sgRNA插入的方向、位置與預(yù)期相符,質(zhì)粒構(gòu)建成功。

下劃線的序列代表sgRNA正向序列。圖4 插入序列的測(cè)序圖

2.3 嘌呤霉素篩選效率的檢測(cè)

經(jīng)過嘌呤霉素梯度濃度的篩選,發(fā)現(xiàn)：1.75 ng/μL和2.00 ng/μL濃度殺死細(xì)胞的效果相近,且都能在7 d內(nèi)將細(xì)胞殺死；而低于1.75 ng/μL的濃度不能將細(xì)胞全部殺死,因此測(cè)試1.75 ng/μL和2.0 ng/μL對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的篩選效率。

將轉(zhuǎn)染打靶質(zhì)粒48 h后的細(xì)胞用含有兩種濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基培育72 h,收取細(xì)胞的基因組DNA作為模板,用特定引物SST-E1-F和SST-E1-R擴(kuò)增DNA片段,預(yù)計(jì)原基因組片段為416 bp,打靶后片段為380 bp；瓊脂糖凝膠電泳顯示的結(jié)果(圖5)與預(yù)期一致。由于1.75 ng/μL和2.0 ng/μL兩種濃度的篩選效果相近,因此選擇1.75 ng/μL為篩選時(shí)嘌呤霉素的濃度。

1:嘌呤霉素濃度為2.00 ng/μL;2:嘌呤霉素濃度為1.75 ng/μL;3:嘌呤霉素濃度為0 ng/μL;4:野生型細(xì)胞;5:清水對(duì)照。圖5 混合細(xì)胞基因型鑒定結(jié)果

2.4 單克隆的基因型鑒定

單克隆鑒定是以經(jīng)過轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選后由單細(xì)胞長(zhǎng)成的克隆為模板,所用引物也為設(shè)計(jì)的SST-E1-F和SST-E1-R,預(yù)計(jì)原基因組片段為416 bp,打靶后片段為380 bp。以挑取的13個(gè)單克隆為模板,電泳圖如圖6所示,兩個(gè)克隆(1、2)沒有片段缺失,4個(gè)克隆(3、4、5、6)雙等位基因雜合片段缺失,7個(gè)克隆(7、8、9、10、11、12、13)雙等位基因片段缺失。經(jīng)過測(cè)序鑒定,7株雙等位基因缺失細(xì)胞都是純合缺失細(xì)胞。

圖6 單克隆細(xì)胞PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

隨著生活水平的日益提高,人們對(duì)動(dòng)物性食品的需求越來越大。我國(guó)是畜禽產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó),如何使畜禽能夠優(yōu)質(zhì)、足量地滿足居民的日常需求、提高畜牧業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)量,是畜牧獸醫(yī)工作者面臨的重要任務(wù)。據(jù)目前的研究,SST在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主要生理功能和作用機(jī)制有兩個(gè)途徑：一是抑制生長(zhǎng)激素的自發(fā)分泌；二是抑制其他因子刺激誘發(fā)的生長(zhǎng)激素的分泌。由于生長(zhǎng)激素釋放被抑制,所以動(dòng)物的生長(zhǎng)會(huì)受到一定程度的限制。畜牧生產(chǎn)行業(yè)通過調(diào)控畜禽機(jī)體內(nèi)的SST水平,可以達(dá)到削弱或消除SST抑制作用的目的,采用的辦法主要有化學(xué)耗竭劑、免疫中和調(diào)控技術(shù)、工程疫苗三種方式[14]。目前,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)被高頻地應(yīng)用到生物研究中,技術(shù)逐漸成熟。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在豬成纖維細(xì)胞中對(duì)SST基因進(jìn)行了敲除。

本研究所用實(shí)驗(yàn)材料是大白豬的腎成纖維細(xì)胞,該細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好,原代的腎成纖維細(xì)胞界限分明,呈不規(guī)則梭形；傳代后死亡率低,95%左右能夠正常貼壁并不斷增殖；匯合度高的細(xì)胞呈較規(guī)則的梭形、流線形或柳葉形,整體排列為渦旋狀或流水狀；凍存再?gòu)?fù)蘇的細(xì)胞貼壁率為90%左右,貼壁后的生長(zhǎng)狀態(tài)也非常良好,能滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。

在本實(shí)驗(yàn)中單克隆細(xì)胞的挑選是主要難點(diǎn)。挑取單克隆細(xì)胞的方法有無(wú)限稀釋法、玻璃拉針劃板法、濾紙?zhí)暨x法等。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用無(wú)限稀釋法分離的單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差甚至衰老速度極快,不能正常增殖,可能是由于單個(gè)細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子等物質(zhì)較少,無(wú)法滿足正常增殖的需求。用玻璃拉針劃線法操作時(shí)對(duì)于貼壁狀態(tài)好的細(xì)胞效果較差,不能使整個(gè)細(xì)胞群脫離培養(yǎng)皿壁,或使大量細(xì)胞破裂,不能貼壁生長(zhǎng)。用濾紙?zhí)暨x法操作時(shí)比較麻煩,且消化的時(shí)間不好掌握。本實(shí)驗(yàn)用自制的克隆環(huán)挑選單克隆細(xì)胞,環(huán)底部略大于克隆,將克隆環(huán)與培養(yǎng)皿底部完全封閉時(shí),可以最大程度地吸取消化的克隆,且能在顯微鏡下觀察消化程度。克隆環(huán)經(jīng)過高溫滅菌,使用前再經(jīng)過紫外照射,能避免感染微生物。使用時(shí)需注意底部是否封閉,若沒有完全封閉,則消化液漏出環(huán)外,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞隨消化液流失,使此克隆作廢,且會(huì)污染其他克隆。本實(shí)驗(yàn)用此方法挑選的克隆經(jīng)再次傳代后,死亡率低,貼壁狀態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)良好。