溫穎婉 陳鈺婷 黎艷

摘 要：目的：建立高效液相色譜法檢測涼茶中頭孢克洛和頭孢呋辛酯的方法。方法：樣品加入甲醇，超聲提取，過濾，用Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，以0.2 mol·L-1磷酸二氫銨-甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長278 nm，光譜掃描波長范圍：0～400 nm，進行定性和定量分析。結(jié)果：頭孢克洛和頭孢呋辛酯檢出限（3倍信噪比）分別為1.9、4.5 ?g·mL-1，定量下限（10倍信噪比）分別為6.3、15.0 ?g·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)均>0.999 0，平均回收率為98.6%～108.7%，相對標準偏差為0.4%～3.3%。結(jié)論：該方法簡單、快速、靈敏，可用于涼茶中2種頭孢菌素的同時篩查。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;頭孢克洛;頭孢呋辛酯;涼茶

Abstract：Objective： To establish a method for determination of cefaclor and cefuroxime axetil in herbal tea by high performance liquid chromatograph （HPLC）. Methods： The samples were added with methanol， extracted by ultrasound， filtered， separated by a Gemini C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， eluted with ammonium dihydrogen phosphate and methanol（0.2 mol·L-1） as mobile phase， with flow rate of 1.0 mL·min-1， detection wavelength of 278 nm， spectral scanning wavelength range of 0～400 nm. Results： The detection limit of cefaclor and cefuroxime axetil（S/N=3） was 1.9 and?4.5 μg·mL-1，the lower limit of quantification （S/N=10） was 6.3 and 15.0 μg·mL-1，the linear correlation coefficient was greater than 0.999 0， the average recovery was 98.6%～108.7%， and the relative standard deviation was 0.4%～3.3%. Conclusion： The method is simple， rapid and sensitive， and can be used for simultaneous determination of two cephalosporins in herbal tea.

Key words：High performance liquid chromatography; Cefaclor; Cefuroxime axetil; Herbal tea

中圖分類號：TS272.7

涼茶是嶺南人民根據(jù)當?shù)囟嘤瓿睗竦臍夂蛱攸c和水土特性，在長期預(yù)防暑熱、疾病的過程中，以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，中草藥為基礎(chǔ)，研制總結(jié)出的一類具有清熱解毒、生津止渴等功效的飲料總稱[1]。若涼茶中隨意加入藥物成分，飲用者易在不知情的情況下和其他藥物同時服用，導(dǎo)致用量難以判斷，危害性極大。國家將其列為食品來管理，按照規(guī)定嚴禁添加藥物成分。

目前，針對涼茶中非法添加化學(xué)藥物的相關(guān)研究較多，如解熱鎮(zhèn)痛類藥物、磺胺類藥物、喹諾酮類藥物、四環(huán)素類藥物都已建立非法添加成分的高效液相色譜測定方法[2]，但頭孢菌素類藥物的非法添加檢測卻較少。頭孢菌素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是一種種類廣泛的抗生素，在現(xiàn)有的抗生素種類中使用普遍，該類藥物由于具有抗菌譜廣、抗菌活性強等特點而廣泛用于治療各種感染性疾病[3]，已成為臨床上常用的抗感染藥物，如頭孢克洛、頭孢呋辛酯等。本文采用高效液相色譜法同時測定涼茶中頭孢克洛和頭孢呋辛酯，為涼茶中非法添加化學(xué)藥物檢測的種類完善，建立簡便有效的檢驗方法，進一步促進涼茶產(chǎn)品的安全規(guī)范，提高從業(yè)者守法經(jīng)營意識，提升行業(yè)規(guī)范經(jīng)營水平。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（安捷倫A1200，二極管陣列檢測器），Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國Phenomenex公司）;ULUP-IV-20T超純水機（中國優(yōu)普公司）;標準物質(zhì)頭孢克洛、頭孢呋辛酯（中國食品藥品檢定研究院）;供試品均為市售宣稱具有清熱解毒功效的涼茶，共25種;甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純;實驗用水均為超純水。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測波長：278 nm;柱溫：40 ℃;流速：1.0 mL·min-1;進樣量：10 μL;光譜掃描波長范圍：0～400 nm;流動相A為0.2 mol·L-1磷酸二氫銨溶液，流動相B為甲醇溶液，流動相梯度洗脫，程序條件見表1。

1.3 分析步驟

1.3.1 混合標準系列溶液的制備

分別精密稱取頭孢克洛、頭孢呋辛酯適量，用甲醇溶解稀釋到一定體積，配成混合標準儲備液，兩種標準物質(zhì)濃度分別為25 μg·mL-1和50 μg·mL-1。用甲醇分別稀釋0、1、2、5、10和20倍，吸取上述濃度混合溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄色譜峰面積，繪制標準曲線。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密量取樣品5 mL于10 mL具塞比色管中，加入甲醇溶液至刻度，振搖，超聲提取30 min，取出后冷卻至室溫。渾濁溶液可取適量3 000 r·min-1離心10 min。上清液經(jīng)微孔濾膜過濾（0.45 ?m，有機相），取濾液作為待測液。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相選擇分別考察0.68%磷酸二氫鉀-乙腈溶液和0.2 mol·L-1磷酸二氫銨-甲醇溶液作為流動相對分離度的影響，結(jié)果顯示，待測物質(zhì)對乙腈親和度高，保留時間較短，涼茶中成分復(fù)雜，待測峰分離度較差，而磷酸二氫銨-甲醇系統(tǒng)可獲得理想的峰圖，故選擇0.2 mol·L-1磷酸二氫銨-甲醇溶液。

2.2 專屬性試驗

在上述優(yōu)化色譜條件下，分別取濃度為25 μg·mL-1的頭孢克洛對照品溶液、濃度為50 μg·mL-1的頭孢呋辛酯對照品溶液、供試品溶液和加標回收溶液進樣，獲得相應(yīng)的色譜圖（圖1），由圖可見，待測物質(zhì)各主成分分離良好，在其相應(yīng)保留時間附近無干擾峰。經(jīng)二極管陣列檢測器同時獲得待測物質(zhì)光譜圖（圖2），若供試品在同一保留時間里出現(xiàn)峰，可用于判定是否為待測物質(zhì)。

注：峰圖從左至右依次為頭孢克洛、頭孢呋辛酯A、頭孢呋辛酯B。

2.3 檢出限

選取待測標準溶液，利用儀器自動進樣，在1.2的儀器條件下，對系列混合標準溶液的進行測定，以標準溶液質(zhì)量濃度x與儀器色譜響應(yīng)峰面積y進行線性回歸（其中頭孢呋辛酯以頭孢呋辛酯A、B異構(gòu)體峰面積之和進行計算）。結(jié)果顯示，頭孢克洛和頭孢呋辛酯分別在1.25～25.00 ?g·mL-1、2.5～50.0 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 0和0.999 9，線性關(guān)系均良好，回歸方程分別為y=7 494.4x+20 650和y=16 563x-17 196。以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算檢出限分別為1.9 μg·mL-1和4.5 μg·mL-1，以S/N=10計算定量下限分別為6.3 μg·mL-1和15.0 μg·mL-1，完全滿足含量分析的要求。

2.4 方法回收率

取空白樣品分別精密量取混合標準系列溶液適量，分別配成低、中、高3個濃度（頭孢克洛濃度分別為1.25、2.50、12.50 μg·mL-1，頭孢呋辛酯濃度分別為2.5、5.0、25.0 μg·mL-1），每個濃度平行測定3份，2種標準物質(zhì)回收率為98.6%～108.7%，相對標準偏差（RSD）為0.4%～3.3%。

2.5 方法精密度試驗

取低、中、高水平3個濃度的混合標準溶液，連續(xù)進樣6次，測定2種標準物質(zhì)的峰面積RSD范圍為0.1%～2.0%。

2.6 重復(fù)性試驗

取2.4項下加入中水平濃度待測物質(zhì)的供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定供試品溶液中待測物質(zhì)含量RSD范圍為0.9%～1.4%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取2.4項下加入中水平濃度待測物質(zhì)的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16 h和24 h進樣測定，并計算各待測物峰面積。結(jié)果顯示，待測物質(zhì)峰面積的RSD分別為0.7%與1.8%，表明待測液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 實際樣品檢測

應(yīng)用本研究建立的方法實際測定市售涼茶樣品25份，其中2份在頭孢呋辛酯相應(yīng)保留時間出現(xiàn)峰圖，2份在頭孢克洛相應(yīng)保留時間出現(xiàn)峰圖，經(jīng)進一步與光譜圖對照，與待測物質(zhì)圖譜不符，均未檢出方法中的待測物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究建立同時測定涼茶中頭孢克洛和頭孢呋辛酯的方法。該方法在頭孢克洛濃度為1.25～25.00 ?g·mL-1，

頭孢呋辛酯濃度為2.5～50.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率達到比較理想水平，方法簡便、重復(fù)性強、靈敏度好、準確性高，為涼茶中非法添加化學(xué)藥物的監(jiān)督檢驗提供了有力的技術(shù)支撐，嚴厲打擊在食品中非法添加藥品的違法犯罪行為，堅決維護消費者的食品安全和生命健康。

參考文獻：

[1]王 萍，肖更生，張友勝，等.廣式?jīng)霾柩芯窟M展[J].食品科技，2010，35（2）：77-80.

[2]溫家欣，陳 林，賴宇紅，等.高效液相色譜法同時快速測定涼茶中11種非法添加化學(xué)藥物[J].分析測試學(xué)報，2016，35（3）：285-291.

[3]Gu B，Zhou M，Ke X，et al.Comparison of resistance to third-generation cephalosporins in Shigella between Europe-America and Asia-Africa from 1998 to 2012[J].Epidemiol Infect，2015，143（13）：2687-2699.

作者簡介：溫穎婉（1983—），女，本科，主管中藥師;研究方向為藥品、食品、化妝品及醫(yī)療器械理化檢驗。