王 燕 毛 勇 張美麗 李 飛 鄧 媛

陜西省微生物研究所，西安710043

飼料中的細(xì)菌數(shù)量會(huì)影響飼料的品質(zhì)，若嚴(yán)重超標(biāo)就會(huì)影響到動(dòng)物、甚至人類(lèi)健康。現(xiàn)行《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 13078-2017 中規(guī)定：飼料中細(xì)菌總數(shù)須小于2×106CFU/g[1]?？梢?jiàn)，細(xì)菌數(shù)量可以直接決定該飼料產(chǎn)品是否合格。國(guó)家要求檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)需求建立評(píng)定測(cè)量不確定度的程序[2]，不確定度值越小，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性越大。因此，實(shí)驗(yàn)室評(píng)定不確定度，可以更科學(xué)、更準(zhǔn)確地驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。本文依照《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》GB/ T13093-2006 標(biāo)準(zhǔn)[3]，測(cè)定了20 份飼料中的細(xì)菌總數(shù)的含量，并計(jì)算評(píng)定了這20 份數(shù)據(jù)的不確定度。

1 材料與方法

1.1 樣 品

客戶送檢的20 份飼料。

1.2 儀 器

精密電子天平、恒溫培養(yǎng)箱（30±1 ℃）、高壓蒸汽滅菌鍋、水浴鍋（46±1 ℃）、振蕩器、無(wú)菌操作臺(tái)。

1.3 耗材與培養(yǎng)基

絲口瓶、1 mL 移液槍及其配套滅菌槍頭、滅菌試管、玻璃珠、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋生產(chǎn)，批號(hào)：18091710）、0.85%無(wú)菌生理鹽水、酒精棉球，所有材料進(jìn)行121 ℃、15 min 高壓滅菌待用。

1.4 檢測(cè)方法

在含有225 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水的藍(lán)口瓶（含玻璃珠）中加入25.0 g 樣品，在搖床上振蕩30 min，充分混勻后作為1∶10 稀釋液待測(cè)。用移液槍吸取1 mL 1∶10 稀釋液至含有9 mL 滅菌生理鹽水的試管中作10 倍稀釋，振蕩搖勻作為1∶100 稀釋液。按上述方法，作系列10 倍稀釋，直到稀釋至1∶100 000濃度。將（1∶1 000）～（1∶100 000）這3 個(gè)濃度的稀釋液分別吸取1 mL，放入一次性無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度作2 個(gè)平行。然后將適宜溫度的約15 mL 培養(yǎng)基倒入平皿，將培養(yǎng)基與稀釋液充分混勻。待瓊脂凝固后，倒置平皿于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，結(jié)果按照國(guó)標(biāo)相關(guān)菌落計(jì)數(shù)法則計(jì)數(shù)。

1.5 測(cè)量不確定度的評(píng)估方法

1）測(cè)量不確定度的來(lái)源。影響不確定度的因素很多，可以從人、機(jī)、料、法、環(huán)這5 個(gè)方面分析原因，該20 份飼料細(xì)菌檢測(cè)的不確定度來(lái)源如下。

①人的因素：盡管為同一試驗(yàn)人員操作，但是同一稀釋度做2 個(gè)平行樣會(huì)引入不確定度。

②儀器及器皿因素：天平稱量、量筒量取是該類(lèi)不確定度的主要因素，本次檢測(cè)使用同一個(gè)天平和量筒，故該項(xiàng)影響值是固定的。

③物料因素：取樣的均勻性、使用的培養(yǎng)基都可產(chǎn)生不確定度。本次檢測(cè)由同一人員操作，使用同一批培養(yǎng)基，而且每個(gè)包裝培養(yǎng)基都做了空白對(duì)照，故該方面影響可忽略不計(jì)。

④方法因素：本次檢測(cè)參照同一檢測(cè)方法執(zhí)行，故該方面影響可忽略不計(jì)。

⑤環(huán)境因素：本次檢測(cè)在同一環(huán)境下進(jìn)行操作，故可忽略該方面影響。

2）測(cè)量不確定度的評(píng)定方法。由上述分析可知，本次檢測(cè)的不確定度來(lái)源主要是由同一稀釋度平行樣因素和天平稱量、量筒量取造成。前者屬于A 類(lèi)不確定度，可以用統(tǒng)計(jì)分析方法評(píng)定；后者屬于B 類(lèi)不確定度，不使用統(tǒng)計(jì)方法評(píng)定，而是用其他方法評(píng)估概率分布假設(shè)來(lái)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)評(píng)定。最終的不確定度是二者的合成不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 A 類(lèi)不確定度

本次20 份飼料細(xì)菌檢測(cè)是由同一個(gè)人檢測(cè)，每個(gè)樣品每個(gè)稀釋度需要測(cè)2 個(gè)平行，數(shù)據(jù)的A 類(lèi)不確定度由2 個(gè)平行數(shù)據(jù)產(chǎn)生。為了讓數(shù)據(jù)更真實(shí)可靠，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)針對(duì)每個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行不確定度評(píng)定。新西蘭某實(shí)驗(yàn)室提出：可以用菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)來(lái)計(jì)算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以減少重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的自由度，便于計(jì)算[4]。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

根據(jù)貝塞爾公式，計(jì)算檢驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)值的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如下：

根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)值的平均值，計(jì)算得到其重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如下：

S值即為A 類(lèi)不確定度。

2.2 B 類(lèi)不確定度

本次檢驗(yàn)的B 類(lèi)不確定度主要是測(cè)量?jī)x器分辨力導(dǎo)致，UB=0.5×δx/k（δx 表示步進(jìn)量，即最小的示值變化量；均勻分布處理，k=）)。在無(wú)菌室稱量樣品25.0 g 至含有225 mL 無(wú)菌生理鹽水中，該過(guò)程使用的電子天平量程為300 g（其步進(jìn)量為0.01 g），量筒容量為500 mL（其步進(jìn)量為5.0 mL），其標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.5×0.01/=0.002 9 g、0.5×5.0/=1.443 3 mL。檢測(cè)時(shí)用1 mL 移液器，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定其容量允許差為1.0[5]，即0.01 mL，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.01/=0.005 8 mL。稀釋過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下[6]：

表1 20 份飼料的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

UB=[（0.0029/25）2+（1.4433/225）2+0.00582]1/2=0.008 6。

UB 的值為0.008 6，對(duì)于UA 0.064 1 而言非常小。而且只要是同一人用同一儀器做同樣的試驗(yàn)，數(shù)值也是固定的，所以在某些文章中不計(jì)算B類(lèi)不確定度，而直接用A 類(lèi)不確定度作為最終的不確定度。

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（Uc）是指當(dāng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)量結(jié)果是由幾個(gè)其他量的值求得時(shí)，按照其他各量的方差和協(xié)方差計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。它是測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的估計(jì)值，表征了測(cè)量結(jié)果的分散性。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度UC=（UA2+UB2）1/2=（0.06412+0.00862）1/2=0.064 8。

2.4 測(cè)量不確定度報(bào)告（擴(kuò)展不確定度）

擴(kuò)展不確定度U=kUC=2×0.0648=0.129 6（置信概率達(dá)P=0.95，包含因子k=2），依據(jù)《GB/T 27418-2017 測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》規(guī)定[7]，本次測(cè)量結(jié)果對(duì)數(shù)值lgX報(bào)告為：（±0.1296）CFU/g（包含因子k=2），以第一組數(shù)據(jù)為例子：=2.3890，其對(duì)數(shù)值的取值范圍在 （[2.3890-0.1296),(2.389 0+0.1296)]，即[2.2594,2.5186]，轉(zhuǎn)換成自然值取整數(shù)為：182～330 CFU/g（包含因子k=2）。

3 結(jié) 論

影響飼料中細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)量不確定度的因素較多，文中對(duì)飼料細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)量不確定度的主要來(lái)源進(jìn)行評(píng)定和分析。其中A 類(lèi)不確定度的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.064 1，B 類(lèi)不確定度的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.008 6，由此計(jì)算得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.064 8。通過(guò)這一試驗(yàn)使得實(shí)驗(yàn)室在飼料細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域建立了初步的不確定度，大大提高了檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。今后要不斷增加該領(lǐng)域的原始檢測(cè)數(shù)據(jù)，擴(kuò)大檢測(cè)樣本，以便獲得更準(zhǔn)確的不確定度。