王 哲 潘幫婷 遲長安 田莉莉

錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001

由致病性大腸桿菌導(dǎo)致的仔豬大腸桿菌性腹瀉是臨床較為常見的傳染性疾病，也是危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要疾病，發(fā)病率及死亡率逐年升高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，臨床上治療由大腸桿菌引起的腹瀉主要應(yīng)用抗生素，由于長期或不當(dāng)使用抗生素藥物使細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性降低，產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性和藥物殘留[2]。因此，采用中藥來預(yù)防和治療大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉具有很好的應(yīng)用價(jià)值和前景。復(fù)合中草藥能反映出中藥學(xué)的特點(diǎn)和優(yōu)勢，要比單味中藥的治療效果好[3]。本試驗(yàn)通過燥濕止瀉顆粒保護(hù)性給藥后，經(jīng)腹腔注射致病性大腸桿菌造成小鼠腹瀉，檢測血清及小腸組織中髓過氧化物酶的活性，以探討細(xì)菌性腹瀉時(shí)燥濕止瀉顆粒對(duì)炎性細(xì)胞在小腸組織浸潤的影響，揭示抗腹瀉的作用機(jī)制，以期為臨床治療大腸桿菌所引起的腹瀉提供理論數(shù)據(jù)和新的思路方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明小白鼠，SPF 級(jí)，購于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，體重達(dá)到22 g 左右進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 菌 種

豬源致病性大腸桿菌O101，菌株為CVCC231，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 主要試劑

燥濕止瀉顆粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；白頭翁散（藥店購入）；酵母粉提取物（OXOID）；胰蛋白胨（OXOID）；髓過氧化物酶測試盒（購于南京建成生物工程研究所）。

1.4 試驗(yàn)方法

1）大腸桿菌菌懸液的制備。將CVCC231 凍干菌株經(jīng)培養(yǎng)后增菌培養(yǎng)2～3 代，挑選單個(gè)菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。OD 值在0.7～0.8 之間，采用平皿表面活菌計(jì)數(shù)法確定菌液濃度為8.6×108CFU/mL。

2）藥物配制。燥濕止瀉顆粒、白頭翁散，用滅菌蒸餾水稀釋，搖勻備用。

3）動(dòng)物分組及給藥。將60 只小白鼠分為6 組，分別為燥濕止瀉顆粒（高、中、低）劑量組、陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組和空白對(duì)照組（表1）。禁食12 h 后，燥濕止瀉顆粒高、中、低劑量組和陽性對(duì)照組保護(hù)性給藥，每只小鼠灌胃容量0.5 mL，每天灌服1 次，連續(xù)灌胃5 d。末次給藥30 min 后，空白對(duì)照組腹腔注射0.5 mL 生理鹽水，其余5 組每只小鼠腹腔注射0.5 mL O101 菌液建立腹瀉模型。

4）樣本采集。小鼠禁食不禁水12 h 后，從小鼠尾靜脈采血0.5 mL，分離血清，備用；用二氧化碳使小鼠死亡，無菌解剖取小腸組織200 mg，用預(yù)冷的PBS 沖洗干凈后放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

5）血清和組織上清的制備及髓過氧化物酶（MPO）活性的測定。小鼠尾靜脈采血，室溫靜置30 min，4℃冰箱過夜，3 000 r/min 離心10 min 取上清，用0.5 mL 的離心管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按MPO 試劑盒說明書方法進(jìn)行，先配制勻漿介質(zhì)，稱取一定質(zhì)量的小腸組織，按體積比1∶19 加勻漿介質(zhì)，制備成5%的組織勻漿。然后按MPO 試劑盒說明檢測血清和小腸組織MPO 的活性。

6）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，使用ANOVA 多重比較分析中的LSD 檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)）檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹瀉模型建立及臨床癥狀

攻毒后，模型組小鼠精神極度沉郁，被毛逆立，卷縮于籠子一角，飲食欲減少至廢絕，腹式呼吸。排便次數(shù)增多，小鼠肛門周圍及尾部粘有黃色稀便，腹瀉率為100%。剖檢變化發(fā)現(xiàn)胃臌氣嚴(yán)重；十二指腸有散在出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)腫脹，腸壁變薄易斷，呈半透明狀；腸管膨脹擴(kuò)張明顯，內(nèi)容物稀薄，呈水樣黃色，與文獻(xiàn)[4]相符。燥濕止瀉顆粒組和陽性對(duì)照組小鼠腹瀉癥狀輕微，精神狀態(tài)良好?？瞻讓?duì)照組小鼠未出現(xiàn)腹瀉癥狀和其他臨床癥狀，剖檢未見異常。

2.2 小鼠血清及小腸組織中MPO 的活性變化

如表2所示，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比小鼠小腸組織中MPO 的活性顯著升高（P＜0.01）；燥濕止瀉顆粒高、中劑量組與模型對(duì)照組相比小腸組織中MPO 的活性顯著降低（P＜0.05）。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組比較血清中MPO 的活性顯著升高（P＜0.01）；燥濕止瀉顆粒高、中劑量組與模型對(duì)照組相比MPO 的活性顯著降低（P＜0.01）。從數(shù)據(jù)結(jié)果得出，燥濕止瀉顆粒能夠降低大腸桿菌引起腹瀉時(shí)小鼠血清及小腸組織中MPO 的活性。

表1 小鼠腹瀉試驗(yàn)分組及給藥

表2 小鼠腸道和血清中MPO 的活性

3 討 論

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）為含鐵溶酶體酶，是過氧化物酶家族的重要成員之一，主要存在于中性白細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞中[5]。MPO 占中性白細(xì)胞蛋白質(zhì)干重的4%，中性白細(xì)胞產(chǎn)生的MPO 占循環(huán)中MPO 含量的95%，MPO 活性的高低直接反映出中性白細(xì)胞的浸潤程度[6]。當(dāng)中性白細(xì)胞在組織中大量浸潤時(shí)，MPO 活性明顯升高，因此通過檢測MPO 活性可以用來表述中性白細(xì)胞的浸潤程度，間接反應(yīng)組織發(fā)生炎癥的程度[7-8]。

MPO 活性是評(píng)價(jià)中性白細(xì)胞在組織中浸潤程度的主要指標(biāo)，MPO 表達(dá)與炎癥發(fā)生的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，檢測MPO 活性可作為腸道損傷程度的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-10]。本試驗(yàn)用燥濕止瀉顆粒預(yù)防性給藥后，腹腔注射致病性大腸桿菌誘導(dǎo)小鼠腹瀉，檢測血清和小腸組織中MPO 活性的變化，觀察能否抑制腹瀉早期炎性細(xì)胞在小腸組織的浸潤。燥濕止瀉顆粒主要是由黃連、黃芩、金銀花、蜘蛛香組成的中藥復(fù)方，主要用于抗炎、抗腹瀉等病癥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、消食止瀉等功效。為了評(píng)價(jià)燥濕止瀉顆粒的藥效，本試驗(yàn)檢測了燥濕止瀉顆粒對(duì)致病性大腸桿菌誘導(dǎo)的腹瀉小鼠血清和小腸組織中MPO的活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，燥濕止瀉顆粒高、中和低劑量組能夠降低MPO 活性，與模型對(duì)照組相比效果明顯。燥濕止瀉顆粒高劑量組與陽性對(duì)照組相比MPO 值偏低，說明高劑量燥濕止瀉顆粒可以明顯抑制腹瀉小鼠腸道炎性細(xì)胞的浸潤，對(duì)于小鼠腸道的保護(hù)作用優(yōu)于陽性對(duì)照藥白頭翁散。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)，中性白細(xì)胞中的MPO 釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[11]。同時(shí)，白細(xì)胞會(huì)跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移由血管壁穿過到達(dá)血管外形成炎細(xì)胞，在細(xì)胞因子的趨化下進(jìn)入組織間隙造成組織浸潤，是機(jī)體感染和炎癥的基本反應(yīng)[12]。

本試驗(yàn)通過腹腔注射大腸桿菌建小鼠腹瀉模型，觀察到小鼠血清及小腸組織中MPO 活性明顯升高，而燥濕止瀉顆粒高、中劑量組可明顯降低腹瀉小鼠血清及腸道中MPO 的活性，與陽性對(duì)照組（白頭翁散）結(jié)果相近，說明燥濕止瀉顆粒能夠抑制炎性細(xì)胞在小腸組織的大量浸潤。揭示燥濕止瀉顆粒對(duì)腹瀉小鼠腸道具有一定的保護(hù)作用，這可能與其抑制中性白細(xì)胞浸潤有關(guān)。