張曉云 顧香玉 趙利娜 鄭香峰 楊紅娟 李 軍 張紅印*

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212003）

葡萄皮薄多汁， 在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中極易受到病原菌的侵染而引起腐爛變質(zhì)， 降低其食用品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。純綠青霉（Penicillium verrucosum）[1-2]、 赭曲霉（Aspergillus ochraceus）[3]、炭黑曲霉（A. carbonarius）[4-6]以及黑曲霉（A. niger）[5-6]等致病菌不僅能引起葡萄采后腐爛， 還會(huì)產(chǎn)生有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物——赭曲霉毒素A（OTA）。OTA 主要以其腎毒性而聞名，此外還具有肝毒性、致癌性、致畸性、免疫以及遺傳毒性等[7]。 葡萄被產(chǎn)OTA 的病原菌侵染后，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 還會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成極大的危害[8-9]，必須采取有效的措施控制葡萄采后病害及OTA 污染?？刂芆TA 產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)是控制葡萄及其制品OTA 污染的最有效措施[10-11]。 利用化學(xué)殺菌劑可有效控制OTA 產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)， 從而控制OTA 的污染。 然而，化學(xué)殺菌劑長(zhǎng)期、大量的使用會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性，造成環(huán)境污染，其殘留和積累還會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成危害[8，12]。 利用拮抗酵母進(jìn)行生物防治的方法逐漸引起國(guó)內(nèi)外研究人員的重視并呈現(xiàn)良好的應(yīng)用前景。

微皺籃狀菌（Talaromyces rugulosus）O1 是本實(shí)驗(yàn)室從葡萄上分離、篩選到的能夠產(chǎn)生OTA 的致病菌[13]，而解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）Y-2 是從葡萄上分離、 篩選到的1 株能夠體外降解OTA 的酵母菌株[14]。 本文以該酵母菌株為研究對(duì)象， 考察其對(duì)不同品種葡萄由微皺籃狀菌O1引起的采后病害以及OTA 積累的控制效果，以期為拮抗酵母在葡萄采后病害和OTA 控制中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備與儀器

全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，美國(guó)zealway 醫(yī)療器械有限公司；Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司； 安捷倫1260 高效液相色譜儀，Agilent Technologies 公司。

1.2 培養(yǎng)基

1）NYDA 培養(yǎng)基 8 g 牛肉浸膏，5 g 酵母浸膏，20 g 瓊脂粉以及10 g 葡萄糖，溶解后用蒸餾水定容1 000 mL，121°C 滅菌20 min。

2）PM 培養(yǎng)基 2 g 麥芽糖，10 g 蔗糖，5 g 酵母浸膏，5 g 蛋白胨， 用蒸餾水定容1 000 mL，121℃滅菌20 min。

3）PDA 培養(yǎng)基 200 g 去皮土豆，將其切塊、煮沸20 min， 過(guò)濾并添加20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂粉，用蒸餾水定容1 000 mL，115°C 滅菌20 min。

1.3 微生物培養(yǎng)

挑取2～3 環(huán)NYDA 斜面上的解脂亞羅酵母Y-2 于含有50 mL PM 培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃、 180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)36 h，然后在4 ℃、7 500×g 條件下離心10 min，收集菌體，用無(wú)菌水洗滌，重復(fù)此操作2 次。以無(wú)菌水調(diào)至合適濃度待用。

挑取PDA 斜面上的微皺籃狀菌O1 孢子，于PDA 斜面上劃線， 置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周，然后以無(wú)菌水洗下孢子， 調(diào)整孢子濃度為1×105孢子/mL。

1.4 葡萄預(yù)處理

采用商業(yè)成熟度良好且表面無(wú)破損、 質(zhì)地均勻、大小一致的葡萄，用自來(lái)水沖洗表面，然后用0.1%NaClO 溶液浸泡1 min， 自來(lái)水沖洗干凈，放入消毒塑料筐中于室溫晾干，備用。

1.5 OTA 濃度的測(cè)定

參考Yang 等[14]的方法，利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定OTA 濃度。 具體條件：Zorbax SBC18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-1%乙酸（體積比60 ∶40），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)均為333 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。

1.6 解脂亞羅酵母Y-2 處理對(duì)葡萄采后病害的控制作用

參考Li 等[15]的方法，用打孔器在葡萄赤道處打孔3 mm（寬）×3 mm（深），每孔接種10 μL 解脂亞羅酵母Y-2 菌懸液。 2 h 后接種10 μL 微皺籃狀菌O1 孢子懸浮液（1×105孢子/mL）。 2 h 后用保鮮膜將塑料筐包裹起來(lái)，置于恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)（25°C，RH 95%）貯藏，分別記錄第14 天葡萄的腐爛直徑。 每框包含36 個(gè)葡萄，每個(gè)試驗(yàn)3 個(gè)平行，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)兩次。以無(wú)菌水代替解脂亞羅酵母Y-2 菌懸液作為對(duì)照組。

考察解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)不同品種葡萄（夏黑、巨峰、紅提）采后病害的控制作用，操作方法同上。 酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL。

考察不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)紅提葡萄采后病害的控制作用時(shí)， 酵母菌懸液的濃度分別為1×106，1×107，1×108，1×109細(xì)胞/mL。

考察解脂亞羅酵母Y-2 處理對(duì)貯藏不同時(shí)間的紅提葡萄采后病害的控制作用， 酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL， 記錄腐爛直徑的時(shí)間分別為9，11，13，15，17 d。

1.7 解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)葡萄中OTA 的控制作用

操作同1.6 節(jié)，14 d 時(shí)測(cè)定不同品種葡萄傷口處OTA 的積累量。 OTA 的提取方法：取腐爛直徑相似的葡萄（夏黑、巨峰、紅提），打漿，將漿液轉(zhuǎn)移至錐形瓶中， 加入一定體積的三氯甲烷， 置于25°C 搖床中緩慢振搖24 h，收集萃取液。 重復(fù)萃取2 次，合并萃取液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。蒸發(fā)結(jié)束后在避光條件下向近干的圓底燒瓶中快速加入1 mL 甲醇復(fù)溶，離心（12 000 × g，15 min）后的上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，用于OTA 濃度測(cè)定。葡萄傷口處的OTA 積累量以ng/傷口計(jì)。

考察解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)不同品種葡萄（夏黑、巨峰、紅提）傷口處OTA 積累的控制作用時(shí)，操作方法同上，酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL。

考察不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)紅提葡萄傷口處OTA 積累的控制作用時(shí)，酵母菌懸液的濃度分別為1×106，1×107，1×108，1×109細(xì)胞/mL。

考察解脂亞羅酵母Y-2 處理對(duì)貯藏不同時(shí)間的紅提葡萄傷口處OTA 積累的控制作用，酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL， 取樣測(cè)定OTA的時(shí)間分別為9，11，13，15，17 d。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)葡萄采后病害和OTA的控制作用

由圖2 可知，微皺籃狀菌O1 在不同品種葡萄傷口處產(chǎn)生的OTA 各不相同， 紅提中含量最高，夏黑和巨峰中OTA 含量極低。 而經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理后， 葡萄傷口處OTA 含量均低于對(duì)照，尤其是紅提傷口處OTA 含量降低最為顯著，與對(duì)照相比降低了83.3%。由于微皺籃狀菌O1 在夏黑

如圖1 所示，解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)不同品種葡萄采后由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛均有顯著的控制作用，能顯著降低葡萄的腐爛直徑。與對(duì)照相比，經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理的夏黑、巨峰和紅提葡萄， 第14 天的腐爛直徑分別降低了28.7%，19.7%和18.5%。和巨峰葡萄中產(chǎn)生的OTA 量太低，因此無(wú)法考察解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)OTA 積累的控制效果。后續(xù)試驗(yàn)選用紅提葡萄作為研究對(duì)象。

圖1 解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛直徑的影響Fig.1 Effect of Y. lipolytica Y-2 on the lesion diameter of grapes caused by T. rugulosus O1

圖2 解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)葡萄傷口處OTA積累量的影響Fig.2 Effect of Y. lipolytica Y-2 on OTA accumulation in the wounds of grapes

近十幾年來(lái)， 國(guó)內(nèi)外利用拮抗酵母控制農(nóng)產(chǎn)品由致病菌引起的采后病害及真菌毒素污染的研究取得一定的成果。Velmourougane 等[16]發(fā)現(xiàn)，用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）處理田間咖啡，可以顯著降低由黑曲霉和赭曲霉引起的發(fā)病率及OTA 的產(chǎn)生。 Zhu 等[17]研究表明，假絲酵母（Candida zemplinina）M3、釀酒酵母M114、釀酒酵母C297、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）M117 和Metschnikowia aff. fructicola M179 5 株酵母菌均能夠顯著抑制葡萄上炭黑曲霉和赭曲霉的生長(zhǎng)及OTA 的產(chǎn)生。 本研究中，解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的采后病害均有顯著的控制效果，能顯著降低紅提葡萄傷口處OTA 的積累。OTA 在葡萄傷口處積累的減少，一方面是由于拮抗酵母抑制了產(chǎn)毒菌的生長(zhǎng)[11，16-17]，另一方面是該酵母對(duì)產(chǎn)生的OTA 的降解作用[14]。

2.2 不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)紅提葡萄采后病害和OTA 的控制作用

如圖3 所示， 不同濃度的解脂亞羅酵母Y-2對(duì)紅提葡萄采后由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛均有控制作用，尤其是高濃度的拮抗酵母。與對(duì)照相比，1×107，1×108，1×109細(xì)胞/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 處理均可顯著減小紅提葡萄的腐爛直徑，且葡萄腐爛直徑隨酵母濃度的增加而減小。 當(dāng)酵母濃度為1×108細(xì)胞/mL 時(shí)， 其腐爛直徑為19.5 mm，相比于對(duì)照（25.8 mm）降低了23.8%。

如圖4 所示， 不同濃度的解脂亞羅酵母Y-2對(duì)紅提葡萄傷口處由微皺籃狀菌O1 產(chǎn)生的OTA積累均有顯著的控制效果。 對(duì)照組葡萄傷口處OTA 積累量為50 ng/傷口， 而經(jīng)1×108細(xì)胞/mL和1×109細(xì)胞/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 處理的葡萄傷口處OTA 積累量分別為5.95 ng/傷口和3.53 ng/傷口，OTA 積累量顯著降低。 葡萄傷口處OTA 的積累量隨著解脂亞羅酵母Y-2 濃度的增加而降低，與葡萄腐爛直徑的變化趨勢(shì)一致。 Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母M114 菌懸液濃度越大，對(duì)葡萄上炭黑曲霉和赭曲霉的抑制作用越強(qiáng)， 測(cè)得的OTA 含量也越小，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

考慮到經(jīng)濟(jì)成本等因素，后續(xù)選用1×108細(xì)胞/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 進(jìn)行試驗(yàn)。

圖3 不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)紅提葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛直徑的影響Fig.3 Effect of Y. lipolytica Y-2 at different concentration on the lesion diameter of red globe grapes caused by T. rugulosus O1

2.3 解脂亞羅酵母Y-2 處理對(duì)貯藏不同時(shí)間的紅提葡萄采后病害和OTA 的控制作用

如圖5 所示， 對(duì)照組和經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2處理的紅提葡萄腐爛直徑均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，尤其是對(duì)照組，葡萄腐爛直徑從14.2 mm（9 d）增到26 mm（17 d）。 而經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理的葡萄腐爛直徑從11.8 mm（9 d）增到19.8 mm（17 d）。 相同時(shí)間，處理組葡萄腐爛直徑均顯著低于對(duì)照組，17 d 的葡萄腐爛直徑降低了23.8%。

如圖6 所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，解脂亞羅酵母Y-2 處理組和對(duì)照組紅提葡萄傷口處由微皺籃狀菌O1 產(chǎn)生的OTA 積累量均逐漸增加。Lahouar 等[18]發(fā)現(xiàn)塔賓曲霉（A. tubingensis）產(chǎn)生的OTA 也隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加， 與本研究結(jié)果一致。 未經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理的對(duì)照組葡萄傷口處OTA 的積累量在第11 天迅速增至35.20 ng/傷口，第17 天達(dá)到最大值（60.20 ng/傷口）；而經(jīng)該拮抗酵母處理的葡萄傷口處OTA 的積累量在同時(shí)間段分別為1.28 ng/傷口和29.1 ng/傷口，顯著低于對(duì)照組， 且處理組葡萄腐爛直徑也顯著低于對(duì)照組，表明解脂亞羅酵母Y-2 處理對(duì)葡萄貯藏過(guò)程中由微皺籃狀菌O1 產(chǎn)生的OTA 積累具有顯著的控制效果。對(duì)產(chǎn)毒菌微皺籃狀菌O1 的抑制作用是其原因之一。

圖4 不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)葡萄傷口處OTA 積累的影響Fig.4 Effect of Y. lipolytica Y-2 at different concentration on OTA accumulation in the wounds of red globe grapes

3 結(jié)論

解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)不同品種的葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的采后病害均有顯著的控制效果， 且能顯著降低紅提葡萄傷口處OTA 的積累。與對(duì)照相比，該酵母處理的夏黑、巨峰和紅提葡萄的腐爛直徑分別降低了28.7%，19.7%和18.5%，紅提葡萄傷口處OTA 積累量降低了83.3%。 OTA在葡萄傷口處積累的減少， 一方面是由于拮抗酵母抑制了產(chǎn)毒菌的生長(zhǎng)， 另一方面是該酵母對(duì)產(chǎn)生的OTA 的降解作用。

隨著酵母濃度的升高，解脂亞羅酵母Y-2 對(duì)紅提葡萄采后病害和OTA 的控制效果增強(qiáng)，葡萄腐爛直徑和傷口處OTA 的積累量均減少。 當(dāng)酵母濃度為1×108細(xì)胞/mL 時(shí)， 紅提葡萄腐爛直徑比對(duì)照降低了23.8%， 傷口處OTA 積累量由50 ng/傷口，降到5.95 ng/傷口。

圖5 解脂亞羅酵母Y-2 處理對(duì)貯藏不同時(shí)間的紅提葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛直徑的影響Fig.5 Effect of Y. lipolytica Y-2 on lesion diameter of red globe grapes stored for different times

圖6 解脂亞羅酵母Y-2 處理貯藏不同時(shí)間的紅提葡萄傷口處OTA 積累的影響Fig.6 Effect of Y. lipolytica Y-2 on OTA accumulation in the wounds of red globe grapes stored for different time

在紅提葡萄貯藏過(guò)程中，相同時(shí)間，解脂亞羅酵母Y-2 處理組紅提葡萄腐爛直徑和OTA 積累量均顯著低于對(duì)照組，表明解脂亞羅酵母Y-2 在葡萄貯藏過(guò)程中對(duì)其采后病害和OTA 的積累均具有顯著的控制效果。