劉權(quán)偉 李婷婷 勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連116600）

抗菌肽（Antimicrobial peptides）是先天免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要的一部分， 它是生物體為抵抗病原微生物入侵，從而形成具有抗菌作用的短肽[1-2]。瑞典科學(xué)家Steiner 等[3]早在1981年就從羅賓蛾（Hyalophoracecropia）中得到具有殺菌活性的短肽Cecropin。 之后，人們陸續(xù)從各種生物體中分離出具有抑菌效果的短肽[4]。由于抗菌肽引起細(xì)胞死亡的機(jī)制不是與細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合， 而是與膜磷脂的非特異性相互作用[5]，所以抗菌肽產(chǎn)生耐藥性的幾率較小[6-7]。 同時(shí)，抗菌肽還具有抗菌譜廣，殺菌活力強(qiáng)等特點(diǎn)，被認(rèn)為是能夠替代抗生素的首選藥物，具有良好的應(yīng)用前景[8]。 人們通過(guò)對(duì)已有抗菌肽的探索， 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)天然抗菌肽具有兩個(gè)相同的特征，首先基本是陽(yáng)離子類型，其次，它主要是一種對(duì)水和脂類都有親和力的兩親結(jié)構(gòu)[9]。 經(jīng)過(guò)大量研究，雖然抗菌肽的殺菌機(jī)理尚未明確， 但大多數(shù)抗菌肽被認(rèn)為作用于細(xì)菌細(xì)胞膜上，發(fā)揮抑菌作用[10]。 另外，抗菌性與抗菌肽肽鏈形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及抗菌肽的生物學(xué)特性等方面也有關(guān)系。 例如含α-螺旋的抗菌肽通常會(huì)穿透細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，導(dǎo)致跨膜電位消散，最終殺死細(xì)菌[11]。

鯰魚(yú)（Clarias fuscus）屬于魚(yú)綱鯰形目鯰科，多數(shù)生活在海水的中、下部，適應(yīng)生存環(huán)境能力較強(qiáng)。 與其它類型的魚(yú)相比，當(dāng)周圍環(huán)境惡劣時(shí)，鯰魚(yú)的體表黏液和內(nèi)臟會(huì)應(yīng)激形成一些抗菌活性物質(zhì)， 尤其是在受傷之后這種活性物質(zhì)的產(chǎn)量顯著增多[12]。 表皮分泌的黏液是魚(yú)類天然免疫的重要部分[13-14]，它主要通過(guò)表皮杯狀或黏液細(xì)胞產(chǎn)生的大分子蛋白發(fā)揮作用[15-16]。 早在1988年，Austin 等[17]初次報(bào)道了虹鱒魚(yú)表皮黏液對(duì)傳染性病原體有顯著的抑制作用， 激發(fā)了研究人員對(duì)魚(yú)類表皮黏液的研究熱情。 Park 等[18]發(fā)現(xiàn)鯰魚(yú)受傷后能夠分泌抗菌肽，Su 等[19]在黃鯰魚(yú)體表黏液中也分離到抗菌肽。 本實(shí)驗(yàn)室研究人員前期[20]從鯰魚(yú)體表黏液粗提物中共分離獲得4 個(gè)抗菌肽氨基酸片段，即：片段1：RLKEKNKA；片段2：RIVELTLPRVSVRL；片段3：KQEIILKF；片段4：RQIKIXRR。 使用這4個(gè)氨基酸片段， 通過(guò)固相合成法合成相對(duì)應(yīng)的抗菌肽凍干粉。 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)氨基酸片段中，由片段2 氨基酸序列合成的抗菌肽抑菌效果最為顯著，具有繼續(xù)研究的價(jià)值。

本文以此段合成抗菌肽為研究對(duì)象， 以腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌為檢測(cè)菌株， 驗(yàn)證了該新型魚(yú)源抗菌肽的抗菌活性， 并對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌，渤海大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室保存；抗菌肽（RIVELTLPRVSVRL，純度97.775%），合成于上海生物工程公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂， 青島海博生物技術(shù)有限公司；GENMED 正苯基萘胺攝入法細(xì)菌膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒， 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

PE Victor X3 多功能酶標(biāo)儀， 美國(guó)鉑金埃爾默儀器；970CRT 熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；E-1045 鍍金儀，日本日立公司；S-4800 掃描電鏡，日本日立公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇景集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司；Biofuge stratus 臺(tái)式高速離心機(jī)， 美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 理化特性預(yù)測(cè) 通過(guò)抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)APD（http：//aps.unmc.edu/AP/main.php）預(yù)測(cè)抗菌肽的理化特性。 進(jìn)入官網(wǎng)后點(diǎn)擊“CalcuLation & Prediction”， 輸入氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。 使 用HeliQuest 軟件（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）對(duì)抗菌肽序列進(jìn)行螺旋輪作圖分析。

1.3.2 抗菌肽抗菌活性試驗(yàn) 采用瓊脂平板擴(kuò)散法測(cè)定其抑菌效果[21]。

1.3.2.1 抑菌活性驗(yàn)證試驗(yàn) 采用牛津杯法[22]。將滅過(guò)菌的牛津杯置于無(wú)菌平板上， 并將15 mL 含測(cè)試菌的瓊脂培養(yǎng)基 （培養(yǎng)基中含菌量約為106CFU/mL）倒入每個(gè)平板中，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯， 向每個(gè)孔中分別加入體積為100 μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的抗菌肽溶液。 最后將平板置于37°C 的恒溫培養(yǎng)箱孵育，24 h 后觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑。 測(cè)量3 次，取平均值。

1.3.2.2 抑菌活性穩(wěn)定性 將1.3.2.1 步驟中的平板置于37°C 恒溫培養(yǎng)箱中，觀察7 d 內(nèi)抑菌圈的變化情況。

1.3.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用微量稀釋法測(cè)定[23]。 將培養(yǎng)至指數(shù)期的細(xì)菌生長(zhǎng)液按照50 μL/孔的用量添至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并將50 μL 經(jīng)二倍稀釋的抗菌肽添至每個(gè)孔，使各孔中抗菌肽的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.500%，0.250%，0.125%，0.063%，0.032%，0.016%。 使用50 μg/mL氨芐青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照， 將等體積的無(wú)菌去離子水作陰性對(duì)照。 將培養(yǎng)板置于37 ℃孵育10 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595值。 通過(guò)比較測(cè)量值，選擇與陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有明顯差異的最低濃度作為抗菌肽針對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度。 獨(dú)立測(cè)定3 次， 取平均值。

1.3.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 將100 μL 活化的腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至含量為106CFU/mL。 按照2%的接種量，分別將腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌接種至新的營(yíng)養(yǎng)肉湯。分別取2 mg 抗菌肽加入適量測(cè)定組菌液中 （60 μL的50%二甲基亞砜中助溶），使最終抗菌肽質(zhì)量為0.5%?？瞻捉M加入等量同濃度的二甲基亞砜，搖床培養(yǎng)（37°C，160 r/min），每隔2 h 測(cè)定1 次其在波長(zhǎng)595 nm 處的吸光值。 橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為OD595測(cè)量值，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 掃描電鏡觀察 取適量腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期， 加入抗菌肽使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，于37°C 繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)完成的細(xì)菌懸浮液置于離心管中， 以4 000 r/min 離心10 min。隨后，先將離心的沉淀部分用無(wú)菌水洗滌，再將其置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定12 h，用無(wú)菌水洗滌3 次，每次10 min。 洗滌后，將細(xì)菌沉淀懸浮在無(wú)菌水中， 取適量滴在干凈的蓋玻片上，冷凍干燥處理12 h。通過(guò)電鏡掃描觀察腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化。

1.3.5 細(xì)菌外膜通透性的測(cè)定 根據(jù)GENMED正苯基萘胺攝入法， 研究鯰魚(yú)體表黏液抗菌肽對(duì)細(xì)菌外膜通透性的影響。 參考細(xì)菌膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，步驟如下：

1）移取1 mL 新鮮菌液（OD600= 0.5）到新的1.5 mL 離心管；

2）放入微型臺(tái)式離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速13 000 r/min，離心時(shí)長(zhǎng)1 min，小心抽去上清液；

3）加 入1 mL GENMED 緩沖液（Reagent A），充分混勻；

4）將其置于13 000 r/min 的微型離心機(jī)，離心1 min，小心取出上清液；

5）重復(fù)步驟3）～4）1 次；

6）加入1 mL GENMED 緩沖液（Reagent A），充分混勻；

7）抽取150 μL 菌液加入96 孔板中；

8）加入45 μL 0.5%抗菌肽和5 μL GENMED 染色液（Regent B）混勻，放入25 °C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 min；

9）快速放入熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光單位（設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，散發(fā)波長(zhǎng)460 nm）；

10）比較不同樣品細(xì)菌的膜損傷程度。

采用970CRT 熒光分光光度計(jì)測(cè)定， 將其參數(shù)設(shè)置為：靈敏度3，掃描速度為高速，EX 縫寬10 nm，EM 縫寬10 nm。

1.3.6 抗菌肽的圓二色譜測(cè)定 將抗菌肽溶解于模擬細(xì)胞膜疏水環(huán)境的PB 緩沖液和2.5%SDS 緩沖液中， 制成一定濃度的抗菌肽溶液。 于室溫測(cè)定，石英樣品池的光程為0.1 cm，帶寬1.0 nm，分辨率0.5 nm， 掃描測(cè)定波長(zhǎng)范圍190～250 nm，掃描速度50 nm/min。圓二色性通過(guò)平均殘基摩爾橢圓率來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化屬性分析

表1 抗菌肽屬性預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of the properties of antimicrobial peptides

物性預(yù)測(cè)顯示： 該抗菌肽氨基酸數(shù)為14，疏水率50%，凈電荷2 z，相對(duì)分子質(zhì)量1 651.034，分子式為C74H135N23O19S0， 蛋白結(jié)合勢(shì)為1.83 kcal/mol。 如圖預(yù)測(cè)顯示該序列多肽可以形成α 螺旋，在同一疏水表面的氨基酸殘基不少于2 個(gè)。 綜合理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明所合成的多肽具有與細(xì)胞膜相互作用的潛力， 且和APD 數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗菌肽AP00450 相似度高達(dá)40%。

根據(jù)ExPASy （The Expert Protein Analysis System）蛋白質(zhì)組學(xué)分析網(wǎng)站提供的在線服務(wù)軟件進(jìn)行螺旋輪圖分析（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）結(jié)果表明該抗菌肽7 個(gè)疏水殘基中有4 個(gè)在同一表面，親水殘基在相反的位置，預(yù)測(cè)該抗菌肽可能形成一種兩親性結(jié)構(gòu)。研究表明，在目前已知的抗菌肽中，它們氨基酸序列的同源性較低。在陽(yáng)離子型抗菌肽中，它們通常由12 至45 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量在5 ku 以下， 最少具有兩個(gè)凈正電荷，具有陽(yáng)離子特征和兩親性[24]。 本試驗(yàn)合成肽鏈物性預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)均符合抗菌肽理化特性。

圖1 抗菌肽的螺旋輪分布Fig.1 Helix distribution of antimicrobial peptides

2.2 抗菌肽抑菌活性

2.2.1 抑菌活性驗(yàn)證 圖2 顯示1.0%的抗菌肽水溶液對(duì)腐敗希瓦氏菌及大腸桿菌的抑制效果?？梢钥闯?， 抗菌肽對(duì)腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性， 抑菌圈大小分別為15.15 mm 和16.56 mm。

圖2 抗菌肽對(duì)細(xì)菌的抑制作用Fig.2 The inhibitory effect of antimicrobial peptides on bacteria

2.2.2 抑菌活性穩(wěn)定性 在上述抗菌活性驗(yàn)證試驗(yàn)基礎(chǔ)上，觀察抗菌肽7 d 內(nèi)抑菌圈的變化。 觀測(cè)結(jié)果表明抑菌圈的大小沒(méi)有明顯變化， 表示抗菌肽的殺菌穩(wěn)定性較好。

2.2.3 最小抑菌濃度 分別將經(jīng)抗菌肽處理的腐敗希瓦氏菌及大腸桿菌菌懸液置于酶標(biāo)儀上測(cè)定其在波長(zhǎng)595 nm 處的吸光度值。 結(jié)果腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.063%，0.032%。

2.3 抗菌肽對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

在不同的生長(zhǎng)階段， 微生物中細(xì)菌懸浮液的吸光度值在一定波長(zhǎng)范圍變化， 并且細(xì)菌懸浮液的濃度與吸光度值成正比。 細(xì)菌生長(zhǎng)可通過(guò)細(xì)菌懸浮液吸光度曲線的趨勢(shì)來(lái)判斷[25]。 圖3 顯示抗菌肽對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響。 兩種指示菌經(jīng)抗菌肽處理后生長(zhǎng)曲線與正常培養(yǎng)的對(duì)照組差異明顯。 對(duì)照組10 h 后呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，20 h 后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)； 而試驗(yàn)組經(jīng)抗菌肽處理， 細(xì)菌未呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且整體數(shù)量較少，說(shuō)明抗菌肽對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用顯著。

圖3 抗菌肽對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effects of antimicrobial peptides on the growth curves of bacteria

2.4 抗菌肽對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響

通過(guò)觀察圖4 和圖5 可知， 未經(jīng)抗菌肽處理的指示菌形態(tài)飽滿，表面光滑且未變形，菌體無(wú)缺損；而經(jīng)0.5%抗菌肽處理12 h 后，菌體發(fā)生扭曲變形，內(nèi)部出現(xiàn)凹陷，且細(xì)胞膜表面粗糙、皺縮，并出現(xiàn)孔洞，導(dǎo)致內(nèi)容物大量泄漏，失去規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 這說(shuō)明該抗菌肽可能是通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄，從而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的。 魏曉曉等[26]用掃描電鏡觀察，修飾后的牛血紅蛋白源抗菌肽JH-3 可引起金黃色葡萄球菌表面皺縮，在大腸桿菌表面形成通道；而謝海偉等[27]發(fā)現(xiàn)合成的鱟素抗菌肽可使大腸桿菌等細(xì)菌細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 細(xì)胞表面可觀測(cè)到坍塌和破裂現(xiàn)象。

圖4 抗菌肽處理腐敗希瓦氏菌的掃描電鏡圖Fig.4 SEM of S. putrefaciens treated with antimicrobial peptides

圖5 抗菌肽處理大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of E. coli treated with antimicrobial peptides

2.5 抗菌肽對(duì)細(xì)菌外膜通透率的影響

通?？咕牡囊志^(guò)程首先是穿過(guò)細(xì)胞壁接觸細(xì)菌細(xì)胞膜， 然后使氨基酸殘基與磷脂雙分子層在靜電作用下發(fā)生結(jié)合， 抗菌肽將疏水端插入細(xì)胞膜的疏水區(qū)域來(lái)改變膜的結(jié)構(gòu)， 破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，最終達(dá)到抑菌效果[28]。 革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜可防止一些物質(zhì)損害細(xì)胞膜的脂多糖和膜蛋白，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞起到保護(hù)作用。正苯基萘胺（1-N-phenyl-naphtylamine，NPN）是一種疏水性（hydrophobic）熒光探針，在磷脂環(huán)境下產(chǎn)生強(qiáng)烈藍(lán)色熒光。 完整的細(xì)菌細(xì)胞外膜對(duì)正苯基萘胺進(jìn)行排斥，一旦膜遭到損害，正苯基萘胺便可進(jìn)入膜磷脂層，從而增強(qiáng)熒光現(xiàn)象，這種熒光現(xiàn)象的強(qiáng)、弱成為常用的評(píng)價(jià)細(xì)胞膜損傷程度的熒光檢測(cè)信號(hào)[29]。 抗菌肽對(duì)兩種指示菌外膜損傷的作用見(jiàn)圖6，與李婷婷等[30]研究結(jié)果類似，添加抗菌肽后，兩組指示菌試驗(yàn)組熒光值比對(duì)照組顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明指示菌外膜受到損傷，表明抗菌肽通過(guò)損害細(xì)菌細(xì)胞外膜使其死亡。

圖6 抗菌肽對(duì)細(xì)菌外膜通透性的影響Fig.6 Effect of antimicrobial peptides on the permeation of bacteria outer membrane

2.6 圓二色譜檢測(cè)

與抗菌肽的氨基酸殘基排列順序相比， 其二級(jí)或高級(jí)結(jié)構(gòu)在研究它們的生物學(xué)功能方面更加重要。 通過(guò)圓二色譜的測(cè)定獲得抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（α-helix）、β-折疊（beta-pleated sheet）、轉(zhuǎn)角（turn）和不規(guī)則卷曲（Random coil）比例。

在該試驗(yàn)中，使用JASCO 715 圓二色譜儀鑒定在不同緩沖液中抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 與王超煒等[31]測(cè)定結(jié)果相符，圖7a 顯示，在PBS 緩沖液中，抗菌肽在波長(zhǎng)200 nm 附近有負(fù)的譜帶，表面抗菌肽在緩沖液中為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)； 圖7b 顯示，當(dāng)周圍環(huán)境替換為模擬膜環(huán)境時(shí)（2.5% SDS 溶液），在波長(zhǎng)192 nm 附近，抗菌肽有正的譜帶，而在波長(zhǎng)208 nm 和222 nm 附近有兩個(gè)負(fù)的譜帶， 表面抗菌肽在模擬膜環(huán)境時(shí)出現(xiàn)典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有α-螺旋的抗菌肽多數(shù)以桶形模型對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)行滲透， 進(jìn)而殺死細(xì)菌[32]。 綜合上述結(jié)果推斷鯰魚(yú)體表黏液抗菌肽憑借桶板模型機(jī)制到達(dá)抑菌作用。

圖7 抗菌肽在不同緩沖溶液中的圓二色譜圖Fig.7 Circular dichroism of antimicrobial peptides in different buffer solutions

3 結(jié)論

體外合成的來(lái)源于鯰魚(yú)體表黏液的抗菌肽對(duì)腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌均有較為明顯的殺菌作用。 該新型抗菌肽對(duì)腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用， 且最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.063%和0.032%。 抑菌機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜、 細(xì)胞壁造成明顯的損傷， 嚴(yán)重破壞微生物的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。 此外， 抗菌肽還通過(guò)增加細(xì)菌細(xì)胞外膜通透性， 使體內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生泄漏。 該抗菌肽在2.5%SDS 溶液中呈典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

4 展望

該新型鯰魚(yú)體表黏液抗菌肽雖然對(duì)多種細(xì)菌有殺傷作用，但是殺菌效率仍有待提高。以該序列為模板，通過(guò)在特定位置刪減、增添優(yōu)勢(shì)氨基酸或者雜合組成新的抗菌肽， 有望在很大程度上提高抗菌肽的抑菌效率。此外，從自然源分離抗菌肽成本較高， 分離過(guò)程復(fù)雜。 而化學(xué)合成肽的價(jià)格昂貴、安全性低，這些都限制了抗菌肽的發(fā)展。 依靠基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗菌肽的高效生產(chǎn)將成為新的研究熱點(diǎn)。