唐世倩，李晟輝，褚春芳，劉菊紅，李珊珊，趙 虹

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 婦科，北京 100026）

子宮內(nèi)膜息肉（endometrial polyps，EP）是子宮內(nèi)膜的良性病變，也是婦科常見疾病，可發(fā)生于青春期后的任何年齡，隨著年齡增加發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1～3]。EP 可以引起異常子宮出血、不孕等多種問題，因此越來越受到人們的關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，參與機(jī)體炎癥表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2 （MMP-2）、MMP-9 在EP 組織中表達(dá)升高，推測(cè)其可能參與了EP 的發(fā)生發(fā)展，但其作用機(jī)理并不清楚。眾多研究表明多種疾病中MMP-2及MMP-9 的改變均與其基因啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)的多態(tài)性相關(guān)，而在EP 組織中是否也存在MMP-2及MMP-9 基因多態(tài)性的改變，尚未見報(bào)道。因此，本研究將探討MMP-2 基因啟動(dòng)子區(qū)-735C/T位點(diǎn)及MMP-9 基因啟動(dòng)子區(qū)-1562C/T 位點(diǎn)多態(tài)性與EP 的相關(guān)性，以期深入了解EP 發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年4月～2019年8月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診，行手術(shù)治療，經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜息肉組織標(biāo)本82 例，作為實(shí)驗(yàn)組。以年齡為匹配條件的同期于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院行子宮內(nèi)膜活檢及正常絕經(jīng)后婦女因子宮脫垂行子宮切除術(shù)的標(biāo)本51 例，經(jīng)病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織，作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象既往均未使用激素藥物治療，且無甲狀腺、子宮肌瘤、惡性腫瘤、糖尿病、多囊卵巢綜合征等病史。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象在納入試驗(yàn)前均被詳細(xì)告知本研究的目的和研究方法，并簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集及DNA 提取

組織標(biāo)本均采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA 濃度及純度。

1.3 MMP-2 基因分型

采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）法對(duì)MMP-2 啟動(dòng)子-735C/T 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型。擴(kuò)增MMP-2啟動(dòng)子-735C/T 位點(diǎn)的上游引物為 5' -ATAGGGTAAACCTCCCCACATT- 3'；下游引物為5'-GGTAAAATGAGGCTGAGACCTG-3'。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，65.5℃退火45s，72℃延伸45s，經(jīng)35 個(gè)循環(huán)，72℃總延伸7min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hinf I（TakaRa生物工程（大連）有限公司合成），于37℃16h 酶切后，于3.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓85V，30min。電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果，記錄并繪制電泳圖譜。PCR 產(chǎn)物 為300bp，T/T 基因型因 存在Hinf I 的識(shí)別位點(diǎn)，產(chǎn)生254bp 和46bp 2 條DNA片段，C/C 基因型因缺乏Hinf I 的識(shí)別位點(diǎn)保持原有PCR 產(chǎn)物300bp 片段，C/T 基因型則顯示為300bp、254bp 和46bp 三條片段（圖1）。

1.4 MMP-9 基因分型

采用PCR-RFLP 法對(duì)MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T 位點(diǎn)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性基因分型。擴(kuò)增MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T 位點(diǎn)上游引物為5'-GCCTGG CAC ATA GTA GGC CC-3'，下游引物為5'-CTT CCT AGC CAG CCG GCA TC-3'。PCR反 應(yīng)條 件為：94℃預(yù)變 性5min，94℃變 性35s、63.5℃退火40s，70℃延伸50s，經(jīng)40 個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶SphI（TakaRa 生物工程大連有限公司合成） 于37℃恒溫水浴過夜約16h 酶切后，進(jìn)行3.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓85V，30min。電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果，記錄并繪制電泳圖譜。PCR 產(chǎn)物為435bp，T/T基因型產(chǎn)生188bp 和247bp 兩條DNA 片段，C/C基因型因缺乏識(shí)別位點(diǎn)保持原有PCR 產(chǎn)物435bp 片段，C/T 基因型有435、247、188bp 3 個(gè)片段（圖1）。

圖1 MMP-2、MMP-9 酶切后PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，所測(cè)基因型和等位基因頻率均采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組和病例組中各基因型頻率，確定選擇對(duì)象的隨機(jī)性。檢驗(yàn)比較正常對(duì)照組與病例組間基因型和等位基因分布頻率的差異。經(jīng)年齡矯正，以非條件Logistic 回歸法計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征

病例組平均年齡為49.37±1.32 歲，對(duì)照組平均年齡44.17±1.69 歲，2 組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），具有可比性。病例組及對(duì)照組MMP-2 啟動(dòng)子-735C/T 位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（均P＞0.05），病例組及對(duì)照組MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T 位點(diǎn)基因型分布也符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律 （均P＞0.05）。

2.2 MMP-2 啟動(dòng)子-735C/T 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較

在子宮內(nèi)膜息肉組織中，MMP-2 啟動(dòng)子-735C/T 位 點(diǎn)T/T、C/T、C/C基因型頻率分別為42.68%、51.22%、6.10%，與對(duì)照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。與C/T、C/C 基因型相比，T/T 基因型使子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加約2.7 倍（OR=2.708；95%CI 1.219～6.014）。并且T、C 等位基因頻率分布差異有顯著性 （P＜0.05）（表1）。-735C/T 位點(diǎn)T 等位基因使子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加約2.8 倍 （OR=2.839；95%CI 1.377 ～5.853）。

表1 2 組研究對(duì)象MMP-2、MMP-9基因型及等位基因的分布

2.3 病例組及對(duì)照組MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較

在子宮內(nèi)膜息肉組織中，MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T 位 點(diǎn)T/T、C/T、C/C 基因型頻率分別為40.24%、39.02%、20.73%，與對(duì)照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。與C/C 基因型相比，C/T、T/T 基因型使子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加約2.3 倍（OR=2.270；95%CI 1.041～4.949）。但T、C 等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

3 討論

子宮內(nèi)膜息肉由子宮內(nèi)膜腺體，間質(zhì)和血管組成，是子宮局部?jī)?nèi)膜過度增殖引起的內(nèi)膜病變，發(fā)病率約1%～8%[4]，較小的息肉可無臨床癥狀，僅在行超聲檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，但體積較大的息肉可引起不規(guī)則陰道出血、不孕等多種臨床癥狀，部分患者子宮內(nèi)膜息肉反復(fù)發(fā)生，甚至?xí)l(fā)生惡變[5，6]，嚴(yán)重影響人們健康。

迄今為止，子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生機(jī)制并不完全明確，目前普遍認(rèn)為其發(fā)生原因與子宮內(nèi)膜的炎癥、體內(nèi)激素環(huán)境紊亂、細(xì)胞因子及受體失調(diào)，細(xì)胞增殖凋亡失衡相關(guān)，其中炎癥因素受到人們的廣泛關(guān)注，當(dāng)子宮內(nèi)膜出現(xiàn)炎癥時(shí)，內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞致炎因子、血管形成因子的表達(dá)上調(diào)，從而引起內(nèi)膜增生，息肉形成。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是目前研究較多的與機(jī)體炎癥改變相關(guān)的酶類，它是一類依賴于鋅、鈣的內(nèi)源性蛋白水解酶，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生[7]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的MMPs有26 種，其主要生理功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，參與人體的生理及病理過程[8，9]。正常生理情況下，MMPs 在機(jī)體內(nèi)表達(dá)量極低，而在胚胎形成、炎癥、新生血管生成、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等條件下表達(dá)水平顯著升高[10]。

MMP-2、MMP-9 均為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，他們由肝細(xì)胞分泌，屬于明膠酶，主要作用為降解基膜的IV 型膠原，參與炎癥的發(fā)生及擴(kuò)散，血管的形成等病理變化[11，12]。為了明確MMP-2、MMP-9 是否與子宮內(nèi)膜息肉這一疾病發(fā)病相關(guān)，2014年張希奇等人研究發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜組織相比，在子宮內(nèi)膜息肉組織中，MMP-2、MMP-9 均呈現(xiàn)出高表達(dá)[13]，2016年，張勤等人再次驗(yàn)證了這一結(jié)果[14]，這些研究表明MMP-2、MMP-9 在子宮內(nèi)膜息肉組織中表達(dá)升高，但引起其升高的原因尚不清楚。

作為酶類，MMPs 的活性可受多個(gè)位點(diǎn)調(diào)節(jié)，研究證實(shí)MMPs 啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)在人群中的分布可能會(huì)導(dǎo)致MMP 表達(dá)水平的差異，導(dǎo)致某些疾病在人群中的易感性不同[15]。MMP-2 基因啟動(dòng)子區(qū)域-735C/T 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)可導(dǎo)致內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子SP1 結(jié)合區(qū)的序列發(fā)生改變，阻礙了啟動(dòng)子SP1 結(jié)合區(qū)結(jié)合特異的核內(nèi)蛋白，從而改變基因轉(zhuǎn)錄的活性及水平[16]，研究發(fā)現(xiàn)MMP2 啟動(dòng)子區(qū)-735 C/T的C/C 基因型與食管癌風(fēng)險(xiǎn)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[17]，C 等位基因與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[18]，當(dāng)T/T 基因型與C/T 基因型存在時(shí)，膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)增加[19]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)MMP-2 啟動(dòng)子-735C/T 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與骨髓增生疾病[20]、卵巢癌[21]等疾病具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組織的MMP-2 啟動(dòng)子區(qū)-735C/T位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間等位基因頻率具有顯著差異性（P<0.01），其中T/T 基因型、T 等位基因均明顯增加子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR 值分別為2.708、2.839，這表明MMP-2 啟動(dòng)子-735C/T 位點(diǎn)多態(tài)性的改變可以影響子宮內(nèi)膜息肉的患病風(fēng)險(xiǎn)。

同樣，1999年Zhang 等人[22]發(fā)現(xiàn)MMP-9 基因啟動(dòng)子區(qū)域存在-1562C/T 多態(tài)性，其位點(diǎn)位于MMP-9 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，同時(shí)是轉(zhuǎn)錄抑制因子所識(shí)別的位點(diǎn)。C/T 的改變可破壞轉(zhuǎn)錄抑制因子的識(shí)別以及結(jié)合的序列位點(diǎn)，因此，具有顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的作用[23]。但目前發(fā)現(xiàn)，MMP-9 基因啟動(dòng)子區(qū)域-1562C/T 位點(diǎn)上兩個(gè)等位基因在不同疾病中的作用不同。2007年Sfar 等人發(fā)現(xiàn)C 等位基因可降低前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而T 等位基因則會(huì)將前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提升3倍[24]，同年Rollin 等人發(fā)現(xiàn)，C 等位基因與肺鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[25]。在本研究中，子宮內(nèi)膜息肉組織標(biāo)本與正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本相比較，MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T 位點(diǎn)等位基因的頻率具有顯著性（P<0.05），與C/C 基因型相比，C/T、T/T基因型可使子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2.270倍，由此推斷C/T、T/T 基因型與子宮內(nèi)膜息肉的易感性正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)方法，首次探討了MMP-2 基因啟動(dòng)子區(qū)域-735C/T 及MMP-9 啟動(dòng)子-1562C/T 基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜息肉之間發(fā)病關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的基因型及等位基因會(huì)影響子宮內(nèi)膜息肉易感性，這一結(jié)果將為進(jìn)一步探討子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。