谷利偉，趙立琴，范博文，劉勇

（黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319）

香蘭素是從香莢蘭豆中提取的一種重要的合成香精，在食品加工，煙草制造等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來，大量文獻表明香蘭素的作用不僅僅局限于食品添加劑領(lǐng)域，其抗炎、抗氧化、抗衰老等作用也正逐一被揭示[1]。在集約化畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵時刻，使用價格低廉、安全、環(huán)保的天然產(chǎn)物提取物作為添加劑已成為養(yǎng)殖戶及消費者均認可的方式[2]。

人們對炎癥反應(yīng)并不陌生，機體遭受到外來微生物侵襲或自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變時，炎癥反應(yīng)會迅速導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放、以及趨化因子等介質(zhì)的產(chǎn)生，以提高抗病能力并對受損的組織或器官進行修復(fù)，是機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)自我調(diào)節(jié)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。而過度的炎癥反應(yīng)卻會對機體造成一系列消極影響，過度的炎癥反應(yīng)在清除外來病原侵襲或恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的同時也會增加機體內(nèi)組織或器官內(nèi)細胞的變性和壞死，影響機體正常的生理功能[3]。巨噬細胞作為天然免疫系統(tǒng)重要的組成部分在機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)過程中扮演著關(guān)鍵的角色。有大量研究表明，巨噬細胞的活化直接介導(dǎo)了內(nèi)源性的炎癥反應(yīng)，并且由于其活化后釋放的大量炎癥因子以及一系列炎癥介質(zhì)進一步放大了炎癥所帶來的負面影響，直接導(dǎo)致周圍功能細胞的氧化、凋亡和壞死[4-5]。如何通過限制巨噬細胞的過度活化，合理的控制炎癥反應(yīng)所帶來的不良影響成為天然免疫領(lǐng)域研究的熱點問題。

巨噬細胞活化及表型轉(zhuǎn)換一直是天然免疫學研究領(lǐng)域的熱點問題。正常的生理狀態(tài)下巨噬細胞以靜息狀態(tài)存在于全身的結(jié)締組織，對機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)進行監(jiān)管。一旦機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變超出了機體可調(diào)節(jié)的閾值或機體遭遇到外來微生物的侵襲時，巨噬細胞會第一時間發(fā)生活化，一方面增強其自身的吞噬能力；另一方面釋放大量的炎癥因子及炎性介質(zhì)來清除入侵的病原微生物并幫助機體進行穩(wěn)態(tài)重塑[6-7]。在巨噬細胞活化過程中，其功能也會隨著表型的變化而發(fā)生明顯的改變。CD11B 作為判斷巨噬細胞活化的重要標志物在巨噬細胞的研究中被廣泛提及。在活化初期或疾病的急性期，巨噬細胞以M1 表型存在，高表達CD68 并發(fā)揮促炎效應(yīng)[8]；而在活化后期或疾病的轉(zhuǎn)歸期，巨噬細胞以M2 表型存在并發(fā)揮抑炎作用，同時伴隨著CD206 的高表達[9]。盡管關(guān)于巨噬細胞表型變換的相關(guān)機制還沒有被完全揭示，但是有大量研究表明NF-κB 信號通路在巨噬細胞活化過程中發(fā)揮了重要作用[10-11]。

基于大量關(guān)于香蘭素抑炎、抗炎的研究，提出疑問，香蘭素是否也在巨噬細胞活化過程中發(fā)揮了重要作用呢？其發(fā)揮抑炎、抗炎的機制又是怎樣的呢？基于這樣的疑問設(shè)計了如下試驗。首先使用LPS 處理巨噬細胞以構(gòu)建巨噬細胞活化模型，進而參考其他研究使用香蘭素對活化的巨噬細胞進行處理以評價香蘭素對巨噬細胞活化的抑制作用，并對其相關(guān)機制進行探討。

1 材料與方法

小鼠巨噬細胞系RAW164.7 細胞，購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

香蘭素（Sigma-Aldrich，美國）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibio，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；p65、P-p65、β-actin 一抗（Cell Signaling Technology，美國）；HRP標記山羊抗兔IgG、HRP 標記山羊抗鼠IgG（Proteintech，美國）；CD11B、CD68 流式一抗（Abcame，美國）；TRIzol （Life Technologies，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche，美國）；熒光染料（TAKARA，日本）；ECL 發(fā)光液（Millipore，美國）DAPI、LPS、BCA 蛋白濃度測定試劑盒增強型、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 RAW164.7 細胞的培養(yǎng)

RAW164.7 巨噬細胞于10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每兩天傳代一次。

1.4 香蘭素及LPS 處理巨噬細胞

將RAW164.7 細胞接種于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，待細胞密度長至80%左右時，使用10 μM LPS 處理6 h 構(gòu)建巨噬細胞活化模型[12]，對照組加入等量培養(yǎng)基；香蘭素處理組在巨噬細胞活化模型構(gòu)建成功后使用200 nM 香蘭素處理細胞4 h 后收集樣品[13]。

1.5 各組巨噬細胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達量

各組細胞處理完成后使用Trizol 法提取細胞內(nèi)總RNA，測定濃度后將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后按25 μL 體系依次加入cDNA、IL-1β 與β-actin 上下游引物（見表1）、熒光染料及滅菌水，每組設(shè)置3 組重復(fù)，預(yù)混后放入PCR 儀中進行擴增。

1.6 流式細胞儀檢測巨噬細胞活化及表型

細胞吸去培養(yǎng)基后，使用預(yù)冷的PBS 洗滌細胞3 次，棄上清。使用0.25%胰酶將細胞消化離心，1 mL PBS 重懸細胞，將細胞密度調(diào)整為1×106個·mL-1，三組細胞分別加入CD11B 和CD68 抗體混勻，37 ℃下孵育30 min，預(yù)冷的PBS 洗滌細胞3 次后裝入流式管內(nèi)，上機檢測。

1.1 試驗細胞系

表1 IL-1β 與β-actin 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification of IL-1β and β-actin

1.7 Western Blot 檢測p65 蛋白活化水平

各組細胞處理后棄去培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3 次，棄上清，加入含有1% PMSF 的RIPA裂解液并刮取細胞，4 ℃裂解20 min。裂解完全的細胞于4 ℃離心機內(nèi)12 000 ×g 離心5 min，吸取上清，使用BCA 法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白體積并加入蛋白上樣緩沖液煮沸使蛋白質(zhì)變性。將30 μg 蛋白樣品加入到10%的預(yù)制膠中，每組設(shè)置3 個重復(fù)樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳。按照三明治樣將PAGE膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，使用5%的脫脂乳室溫封閉1 h，加入p65（使用TBST 按1∶100 比例稀釋），P-p65（使用TBST 按1∶100 比例稀釋），β-actin（使用TBST 按1∶1 000 比例稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 清洗5 次，二抗室溫下孵育1 h，TBST 清洗5 次，ECL 顯影液下進行顯影，統(tǒng)計蛋白表達量。

1.8 免疫熒光檢測p65 入核情況

細胞均勻接種在含有細胞爬片的24 孔板中，待細胞完全貼壁，各組進行不同處理后，4%多聚甲醛室溫下固定細胞2 h。PBST 清洗5 次，每次5 min，使用p65 一抗孵育過夜。使用PBST 清洗5 次，相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h，再次使用PBST 清洗5 次后滴加含有DAPI 的抗淬滅劑，樹蠟封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察p65 位置。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計使用Graphpad Prism 7.0 軟件，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One -way ANOVA）法進行統(tǒng)計并采用平均值±標準差（Mean±SD）表示，P＜0.05 認為有統(tǒng)計學意義。

2 試驗結(jié)果

2.1 香蘭素處理后各組IL-1β mRNA 表達量

各組細胞經(jīng)過不同處理后使用熒光定量PCR 方法對各組細胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達量進行統(tǒng)計以評價香蘭素對巨噬細胞活化的抑制作用。結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過香蘭素處理后，被LPS 活化的巨噬細胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達量顯著下降。

圖1 不同處理組細胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達量Fig.1 IL-1β mRNA expression in each group.*P＜0.05，***P＜0.001

2.2 香蘭素處理后各組巨噬細胞活化水平及表型檢測

各組細胞經(jīng)處理后對巨噬細胞活化標志物CD11B 以及M1 表型的標志物CD68 進行熒光染色，使用流式細胞儀對各組內(nèi)標志物表達水平進行檢測。結(jié)果如圖2 所示，（A）為流式細胞儀檢測圖，圖中左下角為雙陰性細胞，右下角為CD11B 陽性細胞，左上角為CD68 陽性細胞，右上角為CD11B、CD68 雙陽性細胞。（B）圖為各組內(nèi)CD11B 陽性細胞率（右下角細胞量及右上角細胞量總和），（C）圖為CD11B 及CD68 陽性細胞量（右上角）。與對照組相比，LPS 組CD11B 陽性細胞顯著增加，LPS+香蘭素組無差異；同樣，與對照組相比，CD11B 及CD68 雙陽性細胞在LPS 組顯著增加而LPS+香蘭素組差異不顯著。

圖2 不同處理組細胞內(nèi)CD11B 及CD68 熒光染色后流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.2 CD68 and CD11B level measured by flow cytometry in each group

2.3 香蘭素處理后各組細胞內(nèi)NF-κB 中p65 亞基活化水平檢測

各組細胞經(jīng)過不同處理后使用Western bolt 方法對各組細胞內(nèi)p65 亞基的磷酸化蛋白的表達量進行統(tǒng)計以評價香蘭素對巨噬細胞活化的抑制作用。結(jié)果如圖3 所示，（A）圖為各組p65 蛋白磷酸化水平，（B）圖為各組蛋白表達量統(tǒng)計圖。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS 組p65 亞基磷酸化水平顯著增加，經(jīng)過香蘭素處理后，被LPS 活化的巨噬細胞內(nèi)磷酸化的p65 蛋白表達量與對照組相比無顯著差異。

2.4 香蘭素處理后各組細胞內(nèi)NF-κB 中p65 入核現(xiàn)象檢測

各組細胞經(jīng)過不同處理后使用免疫熒光方法對各組細胞內(nèi)p65 亞基的入核情況進行觀察以評價香蘭素對巨噬細胞活化的抑制作用。結(jié)果如圖4 所示，與對照組相比，LPS 處理細胞后，p65 亞基均定位在核內(nèi)，而使用香蘭素處理后，p65 亞基大量定位于細胞質(zhì)。

圖3 不同處理組細胞內(nèi)磷酸化p65 表達量Fig.3 p65 activated expression measured by western bolt in each group

圖4 不同處理組細胞內(nèi)p65 入核現(xiàn)象Fig.4 The level of p65 in nucleus measured by immunofluorescence in each group

3 討論

試驗通過使用LPS 處理巨噬細胞構(gòu)建巨噬細胞活化模型，添加香蘭素以評價其抑炎、抗炎作用，并對其機制進行了初步的探討。結(jié)果顯示，添加香蘭素對LPS 誘導(dǎo)活化的巨噬細胞有明顯的抑制作用，其作用機制中可能是通過抑制NF-κB 信號通路內(nèi)p65亞基的活性，阻礙其入核從而達到抑制巨噬細胞活化的作用。

眾所周知，巨噬細胞活化后會產(chǎn)生大量的炎癥因子以達到清除外來入侵物質(zhì)，協(xié)助機體進行穩(wěn)態(tài)重構(gòu)的目的，在這其中，IL-1β 是巨噬細胞活化后釋放的首要細胞因子。大量研究表明，巨噬細胞活化后會釋放IL-1β 從而誘發(fā)內(nèi)源性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡和壞死[14]。試驗中，我們發(fā)現(xiàn)使用LPS 處理巨噬細胞后，IL-1β 的mRNA 表達水平顯著增加，而使用香蘭素處理后活化的巨噬細胞內(nèi)IL-1β 的mRNA 表達水平被顯著抑制，與對照組相比無顯著性差異，試驗結(jié)果初步表明香蘭素可以顯著抑制巨噬細胞的活化，減少IL-1β 的合成。我們又對各組巨噬細胞活化標記物CD11B 及M1 表型標記物CD68 進行熒光染色，使用流式細胞儀進行檢測并對活化的巨噬細胞及M1 表型數(shù)量加以統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，在使用LPS 處理后CD11B 陽性細胞數(shù)顯著增加，而添加香蘭素后CD11B 的陽性細胞數(shù)量顯著減少，與對照組相比無顯著性差異。不僅如此，CD68/CD11B 雙染結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS 組雙陽性細胞數(shù)極顯著增加，而LPS+香蘭素組雙陽性細胞無顯著性差異。CD11B 是免疫相關(guān)性細胞活化的主要標記物，通過參與補體系統(tǒng)的活化過程發(fā)揮免疫細胞的粘附、遷移和吞噬功能并且放大了免疫細胞的炎癥反應(yīng)，造成細胞毒性，誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。CD68 作為B 類清道夫樣受體家族的一員是包括巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞在內(nèi)的免疫相關(guān)性細胞的特異性標記物[16]。盡管釋放炎性因子是巨噬細胞活化的重要標志，但巨噬細胞通過增加其表面相關(guān)受體的活化從而發(fā)揮其吞噬和粘附作用是巨噬細胞活化后的第一響應(yīng)信號，優(yōu)先于其炎性因子的釋放。因此，根據(jù)巨噬細胞表面吞噬和粘附相關(guān)受體的活化水平來判定巨噬細胞狀態(tài)更為直觀[17]。不僅如此，關(guān)于巨噬細胞M1 和M2 表型轉(zhuǎn)換的研究一直熱度不減，盡管并沒有完全闡明巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換的相關(guān)機制，但是M1 型巨噬細胞的促炎功能和M2 型巨噬細胞的抑炎功能已被揭示[18]。在巨噬細胞活化后，大量的模式識別受體會迅速活化并對機體內(nèi)的一系列變化做出響應(yīng)，此時的巨噬細胞表現(xiàn)出的作用為“清除”和“識別”，為M1型；而在疾病的轉(zhuǎn)歸期，巨噬細胞的功能和角色又發(fā)生改變，表現(xiàn)為“修復(fù)”和“保護”，為M2 型。CD68 作為清道夫樣受體家族的一員在M1 表型的巨噬細胞中參與了大量的吞噬和識別過程，是M1 型巨噬細胞的重要標志之一[19]。試驗發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞活化模型內(nèi)加入香蘭素后，其M1 表型標記物CD68 及活化標記物CD11B 數(shù)量均顯著下調(diào)，說明巨噬細胞活化后其吞噬能力被顯著抑制，并且結(jié)合其IL-1β mRNA表達量顯著下調(diào)這一試驗結(jié)果，確定香蘭素可以通過抑制巨噬細胞吞噬能力，下調(diào)其促炎因子的釋放的方式，阻礙由LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞的活化及分化過程。

在明確了香蘭素對于LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞活化及分化的抑制作用后，我們又對其在巨噬細胞內(nèi)發(fā)揮抑炎、抗炎作用的相關(guān)機制進行了初步探討。使用Western blot 方法對NF-κB 通路內(nèi)p65 亞基的磷酸化水平進行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，使用LPS處理后的巨噬細胞中p65 蛋白的磷酸化水平顯著增加；而在添加了香蘭素后這種升高趨勢被顯著抑制。不僅如此，免疫熒光結(jié)果顯示在LPS 刺激組，核內(nèi)p65 的熒光強度顯著增強而在使用了香蘭素后，定位于核內(nèi)的p65 熒光強度下降，表明LPS 可以增加p65的入核，而使用香蘭素后會顯著抑制其入核過程。NF-κB 信號通路作為天然免疫系統(tǒng)內(nèi)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子可被各種因素激活從而促進包括各項炎癥因子及炎癥介質(zhì)在內(nèi)的靶基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB 是由p65和p50 兩個同源二聚體亞單位構(gòu)成，在正常生理條件下與其抑制因子IκB 組成無活性的三聚體定位于細胞漿參與細胞的增值與分化過程，而當接收到模式識別受體傳入至胞內(nèi)的信號后，包括IκBα 再內(nèi)的IκB 迅速從三聚體上解離被泛素化酶體系統(tǒng)降解，喪失對p65 和p50 亞基的限制作用，而p65 和p50 亞基從三聚體單位上解離后，迅速暴露其絲氨酸及蘇氨酸殘基并通過磷酸化修飾增加其活性并迅速移位入核，促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄過程[20]。多項研究表明p65 的活化入核過程直接介導(dǎo)了包括巨噬細胞在內(nèi)的免疫相關(guān)性細胞的活化[21]，而在使用香蘭素后Western blot 及免疫熒光結(jié)果均顯示p65 亞基的活化均被抑制，這可能直接參與了香蘭素的抑炎和抗炎過程，抑制巨噬細胞的過度活化及活化過程。

綜合以上試驗結(jié)果分析得出結(jié)論，香蘭素通過限制NF-κB 信號通路中的p65 活性，抑制巨噬細胞的活化及分化以達到其抗炎抑炎的效果。而在日后的畜禽集約化養(yǎng)殖過程中可以通過適當?shù)奶砑酉闾m素以達到提升畜禽抗病能力、降低養(yǎng)殖成本的目的。

4 結(jié)論

試驗中，通過LPS 處理巨噬細胞以構(gòu)建巨噬細胞活化模型并使用香蘭素處理后發(fā)現(xiàn)，香蘭素可通過作用于NF-κB 內(nèi)p65 亞基，通過抑制其磷酸化、阻礙其活入核最終達到其抗炎、抑炎的功能。