于國偉，劉行波，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR） 是牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一種急性發(fā)熱型傳染病。根據(jù)感染的組織器官不同，可分為生殖道型、呼吸型、眼型、腦膜炎型和流產(chǎn)型五種。僅感染牛傳染性鼻氣管炎的牛，不會有較高的死亡率，但是它能導致母牛的產(chǎn)奶量下降、肉牛生長緩慢，從而給養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。

IBRV 在生物學分類上被劃分為皰疹病毒科a-皰疹病毒亞科[4]。該病的感染的主要來源是帶毒的病畜[5]。實驗發(fā)現(xiàn)在山羊和豬的死胎、水獺和雪貂中均能夠分離出該病毒來[6]；人工感染實驗表明，牛在多種途徑下都容易感染，但對于綿羊、馬、豬、貓、狗、豚鼠和小鼠等動物在測試時均表現(xiàn)出抗性。在對鹿進行不同途徑的人工感染實驗時，這些患病鹿均能產(chǎn)生于牛相似的臨床癥狀并能夠檢測出相應的抗體[7]。該疾病在秋季和寒冷的冬季更為普遍，尤其是在較為集中和擁擠的情況下飼養(yǎng)的大群奶牛中。此外，應激因素、社會因素、發(fā)情和分娩等因素與本病的發(fā)生也密切相關[8-9]。

疫苗免疫是預防和控制本病的主要手段[10]，歐洲采用撲殺抗體陽性牛的方式消除本病成本過高，與我國國情不符。目前國內(nèi)預防本病的疫苗為IBRV 和BVDV 二價滅活疫苗，歐美普遍采用IBRV gE 基因缺失疫苗，但該疫苗對于懷孕母牛以及新生牛安全性不佳[11]。作為獸用疫苗經(jīng)濟效益是首要考慮問題亞單位疫苗因為生產(chǎn)成本問題無法在獸用領域廣泛應用。DNA 疫苗因其安全性高、成本低、制備容易、能引起較高的細胞免疫水平，在獸用疫苗領域有極好的應用前景，但由于其無法高效進入細胞內(nèi)進行高效蛋白表達，進而引起較高的體液免疫水平，而無法廣泛應用[12-13]。

1995 年首次發(fā)現(xiàn)PEI（聚乙酰亞胺）可以作為載體輸送DNA 進入真核細胞，從此對PEI 作為載體的研究進入了一個高潮，PEI 作為載體的機制是其特殊的富含陽離子結構可以中和DNA 的負電荷從而形成帶有正電荷的轉(zhuǎn)染復合物進入到細胞。它不僅能夠大規(guī)模的生產(chǎn)而且成本方面較其他轉(zhuǎn)染試劑具有天然的優(yōu)勢，且PEI 是化學成分固定并是非生物來源不會引起免疫反應，因此被廣泛應用，聚乙酰亞胺（PEI）作為一種帶有強正電荷的有機聚合物，作為DNA 和RNA 載體用于體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染已有多年，但因其毒性較大，一直未獲得足夠的安全性[14]。聚乙二醇（PEG）作為具有較好生物相容性的聚合物，一直以來用于人蛋白藥物等相關藥物研究，經(jīng)過大量研究證明其在體內(nèi)不被降解，不產(chǎn)生毒副作用，應用范圍越來越廣，它是典型的無毒、非免疫原性、非抗原性的聚合物，已經(jīng)被作為一種最常用的修飾物質(zhì)，據(jù)報道，它除了具有良好的生物相容性和安全性之外，PEG 所修飾的磁性載體能夠隱藏起來在避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別從而不被吞噬，從而能夠延長藥物在血液中的循環(huán)時間，因此被廣泛應用于降低PEI 毒性[15]。研究以50 nm PEI 磁珠作為載體吸附gB gC gD基因的真核表達質(zhì)粒，并在其表面包裹一層雙羧基PEG600 作為保護層，以提高其安全性驗證其在體外細胞水平能否表達。

1 材料與方法

1.1 真核表達質(zhì)粒與細胞

pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His 真核表達質(zhì)粒由實驗室構建完成并保存。小鼠胚胎細胞（NIH/3T3）由實驗室保藏。實驗室已成功根據(jù)GenBank 公布的IBRV（Cooper1）株（GenBank 登錄號Z78205）gB、gC、gD基因構建了基因全長真核表達質(zhì)粒。并在gB基因上下游加入HindⅢ、AgeⅠ酶切位點，在gC基因上下游加入KpnⅠ、BSTBⅠ酶切位點，在gD基因上下游加入KpnⅠ、BSTBⅠ酶切位點。

1.2 主要材料及試劑

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，購自天根生化有限責任公司。HindⅢ、KpnⅠ、AgeⅠ、BSTBⅠ限制性內(nèi)切酶，均采購于Thermo Fisher 公司，PEG、PEI 磁珠購自英芮誠（Enriching）生化上海有限公司，His 標簽單克隆抗體購自美國abcam 公司（1∶10 000 稀釋），羊抗鼠HRP 二抗，購自北京博奧森生物（bioss），ECL 顯色液，購自索萊寶生化有限公司。兔抗小鼠多克隆抗體由實驗室制備并保存。

1.3 重組質(zhì)粒的提取及酶切鑒定

將實驗室構建完成的pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His 真核表達質(zhì)粒在含有25%甘油的Top10 菌種中取復蘇后在無菌環(huán)境下分別將其接種至5 mL 含有1%氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，放置于搖床130 r·min-1，12 h。小提質(zhì)粒后，根據(jù)表1 中的酶切位點，對擴增后的pCDNA4-gB/gC/gDHis 質(zhì)粒雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒送至哈爾濱博仕生物有限公司進行序列的測定。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎細胞（NIH/3T3）

取質(zhì)粒5 μg 加入含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基對NIH/3T3 細胞系進行培養(yǎng)。待細胞生長至細胞瓶90%時進行轉(zhuǎn)染操作，按照每10 μg 質(zhì)粒對應20 μL PEI 磁珠的比例均勻混合，使質(zhì)粒吸附到磁珠上，將細胞瓶中處于對數(shù)生長期的NIH/3T3 細胞吹打下來，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，在2 000 r·min-1條件下離心3 min，棄掉上清，將所得到的沉淀加入1 mL 無血清的DMEM 培養(yǎng)基中，并將細胞吹打混勻后轉(zhuǎn)移至新的細胞瓶，加入足量的10% FBS 1640 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d 后蛋白開始表達。

1.5 Western Blot 檢測蛋白表達情況

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后72 h，收取轉(zhuǎn)染后的上清，對細胞進行蛋白純化驗證，用鎳柱進行蛋白純化。純化后蛋白按照每孔10 μg 蛋白上樣，140 V 條件下電泳55 min，250 mA 條件下濕轉(zhuǎn)，90 min，用5%脫脂乳4 ℃封閉過夜。過夜后的樣品加入小鼠抗His 標簽單克隆抗（1∶10 000 稀釋）37 ℃孵育2 h，PBST 清洗3 次，每次清洗5 min，用山羊抗小鼠辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶2 000 稀釋）加入所得到的樣品，37 ℃孵育45 min，PBST 清洗3 次，每次5 min，濾紙吸干PBST，加入500 μL ECL 顯色液（A∶B 液1∶1 混合）2 min，濾紙吸干顯色液，用ECL 顯色儀曝光10 s讀取顯色圖片并進行分析。

1.6 間接免疫熒光檢測表達情況

實驗前一天，將小鼠胚胎細胞（NIH/3T3）接入鋪有22 mm×22 mm 蓋玻片的六孔板中，第二天，待小鼠胚胎細胞（NIH/3T3）密度達到80%左右開始進行染色步驟。用新鮮配制的2%多聚甲醛固定細胞10 min 清洗后，用0.2%～0.5% Triton X-100（PBS 配制）對細胞透化處理10 min，再次清洗。用2%BSA 封閉30 min，加入實驗室制備的兔抗IBRV 多克隆抗體500 倍稀釋，室溫孵育1 h。PBS 清洗后，加入200 μL羊抗兔二抗（FITC 標記），室溫孵育30 min。細胞核染色：加入0.5 μg·mL-1DAPI（PBS 配制）染色3 min 用PBS 洗3 遍，去除多余的DAPI。加入20 μL 封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并分析結果。

1.7 大提質(zhì)粒

取上步復蘇菌種（pCDNA4-gB-HisB、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His）接種至1 L 氨芐LB 培養(yǎng)基中放37 ℃恒溫搖床搖12 h，將所得的菌體放置于恒溫高速離心機內(nèi)，4 ℃，12 000 g·min-1離心分4 min，收集菌體沉淀，所得到的菌體沉淀按照天根生化公司出品的大提質(zhì)粒試劑盒說明書進行大提質(zhì)粒并將得到的質(zhì)粒進行濃度測定且用0.22 μm 無菌濾器進行過濾，-20 ℃保存用于后續(xù)實驗。

1.8 PEI 磁珠最大吸附量的確定

將50 μL PEI 磁珠分別加入50、100、150、200、250、300、350 μg 的pCDNA4-gB-His 質(zhì)粒到無菌1.5 mL EP 管內(nèi)，終體積均為1 mL 并混合均勻，12 000 r·min-1離心5 min 收集上清，用微量紫外分光光度計測定各EP 管上清中DNA 濃度，加入量減去上清中總DNA 含量，計算磁珠載量。

1.9 疫苗的制備

實驗前經(jīng)電鏡下觀察50 nm PEI 形態(tài)后將大提并鑒定純度后的pCDNA4-gB-HisB、pCDNA4-gCHis、pCDNA4-gD-His 真核表達質(zhì)粒按1∶1∶1 的比例均勻混合，并分為A，B 兩組，將A 組加入50 nm 的PEI 磁珠室溫靜置2 h，B 組加入50 nm 磁珠的同時加入PEG 靜置吸附2 h。對吸附后的質(zhì)粒進行電鏡觀察，確定吸附效果。

2 結果

2.1 質(zhì)粒酶切鑒定及測序結果

經(jīng)送gB/gC/gD 克隆質(zhì)粒測序結果表經(jīng)BLAST比對，同源性均達到99%以上。將質(zhì)粒酶切后的結果如圖1 所示：gB 基因酶切后可得到2 780 bp 的目的條帶，gC 基因、酶切后可得到1 587 bp 的目的條帶，gD 基因酶切后可得到1 396 bp 的目的條帶，目的基因大小與插入序列相符。結果表明成功復蘇了由實驗室構建完成的pCDNA4-gB/gC/gD-His 真核表達質(zhì)粒。

圖1 質(zhì)粒酶切鑒定結果Fig.1 Identification results of plasmid double enzyme digestion

2.2 gB/gC/gD 蛋白在小鼠胚胎細胞（NIH/3T3）表達結果

為驗證構建的pCDNA4-gB/gC/gD-His 真核表達質(zhì)粒能否能否體外表達gB/gC/gD 蛋白，采用Western Blot 方法對其進行驗證。結果見圖2 可檢測到相應的gB，gC，gD 蛋白（60 Kda）的出現(xiàn)，證明了重組質(zhì)粒能夠在小鼠胚胎細胞進行表達。

2.3 間接免疫熒光結果

將處理好的小鼠胚胎細胞（NIH/3T3）置于免疫熒光顯微鏡下進行觀察，可見到轉(zhuǎn)染pCDNA4-gBHis、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His 的真核表達質(zhì)粒的細胞有明顯的綠光（圖A-C），而轉(zhuǎn)染了pCDNA4-His 的對照細胞無特異熒光（圖D）。結果表明真核表達質(zhì)?？稍谛∈笈咛ゼ毎M行有效表達。

圖2 轉(zhuǎn)染后pCDNA4-gB/gC/gD-His 在NIH/3T3 表達鑒定Fig.2 Expression identification of pCDNA4-gB/gC/gD-His eukaryotic expression plasmid in NIH/3T3 after transfection

圖3 pCDNA4-gB/gC/gD-His 真核表達質(zhì)粒體外感染小鼠胚胎細胞間接免疫熒光檢測基因表達（100×）Fig.3 Indirect immunofluorescence assay for analyzing gene expression in mouse embryonic cells infected with pCDNA4-gB/gC/gD-His eukaryotic expression plasmid in vitro（100×）

2.4 PEI 最大吸附量的確定

經(jīng)測定100 μL 50 nm PEI 磁珠最大吸附量為60 μg pCDNA4-gB-His 質(zhì)粒。

2.5 50 nm PEI 磁珠吸附前及吸附后電鏡結果

電鏡結果顯示PEI 磁珠吸附前形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙（圖A）。吸附質(zhì)粒后粒徑變大，表面粗糙程度減少（圖B）。添加的PEG 能夠?qū)①|(zhì)粒包覆粒徑變大，表面粗糙程度繼續(xù)減少（圖C）。

圖4 PEI 磁珠吸附前后電鏡結果（80 000×）Fig.4 Electron microscopy results before and after PEI magnetic beads adsorption（80 000×）

3 討論

牛傳染性鼻氣管炎病毒基因組為雙股線性DNA分子，囊膜表面分布11 種糖蛋白，這些糖蛋白在病毒致病性和免疫功能上有著不可替代的重要性。研究表明gB 基因表達的蛋白高度保守而且在病毒感染的過成中是必不可少的，該蛋白是刺激宿主免疫應答的主要的抗原蛋白之一[16]。gC 基因表達的蛋白是最重要的IBRV 吸附蛋白，據(jù)文獻報道gC 基因所表達的蛋白與細胞表面的糖蛋白相互作用，不僅能夠介導病毒吸附的起始，還能夠誘導細胞介導的免疫反應[17]。gD 基因所表達的蛋白位于病毒囊膜和感染細胞的表面，對病毒復制至關重要[18]。正是由于這些因素決定了本試驗選擇gB/gC/gD 基因作目的基因進行真核表達質(zhì)粒的構建。

PEI 作為載體的機制是其特殊的富含陽離子結構可以中和DNA 的負電荷從而形成帶有正電荷的轉(zhuǎn)染復合物進入到細胞。它不僅能夠大規(guī)模的生產(chǎn)而且成本方面較其他轉(zhuǎn)染試劑具有天然的優(yōu)勢[19-21]。常用DNA 轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體、PEI、電轉(zhuǎn)等。其利用原理均為正電荷促進帶負電荷的DNA 進入細胞，進而有利于免疫細胞識別[22]。但是PEI 由于其毒性較強，并未大量普及[23]。研究基于單純使用PEI 作為轉(zhuǎn)染試劑的毒性問題，特制備了50 nm 粒徑的磁珠。其具有納米粒徑具有容易被細胞吞噬、用四氧化三鐵作為納米粒子核可以極大減少同等轉(zhuǎn)染條件下PEI的用量，減少PEI 毒性、用長鏈PEI 作為包裹層可以增強其正電荷方面進行多層修飾等優(yōu)點。李繼昌[24]研究表明小鼠單獨注射以gD 基因為抗原的DNA 疫苗所產(chǎn)生的抗體明顯弱于脂質(zhì)體和gD 基因混合免疫的小鼠。孫澤強[25]以腎癌G250 為抗原制備DNA 疫苗與PEI 混合對小鼠進行免疫，結果表明免疫PEI與DNA 疫苗混合的試驗組相比于只免疫DNA 疫苗的試驗組能夠產(chǎn)生極為明顯的細胞免疫與體液免疫。綜上所述，試驗設想將PEI 與pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His 真核表達質(zhì)?；旌夏軌虍a(chǎn)生更為顯著的免疫水平。

為鑒定所構建成功的真核表達質(zhì)粒能否在體外有效表達，試驗采取了Western-Blot 和間接免疫熒光兩種方法來對其進行驗證，結果顯示pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His 真核表達蛋白均可與His 標簽抗體發(fā)生特異性反應。間接免疫熒光結果顯示轉(zhuǎn)染了pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His 真核表達質(zhì)粒的小鼠胚胎細胞產(chǎn)生特異性熒光，轉(zhuǎn)染的空載體質(zhì)粒并無特異性熒光出現(xiàn)。以上試驗均可證明所構建的真核表達質(zhì)粒在小鼠胚胎細胞中得以表達，所制備的疫苗經(jīng)電鏡結果可見質(zhì)粒能夠成功吸附在PEI 磁珠上，與設想相符，這為牛傳染性鼻氣管炎DNA 疫苗的研究工作奠定了基礎。這對IBR 的防治方式進行了一種新的研究，也為獸用DNA 疫苗研發(fā)做出有益探索。