黃晶 潘宜云 鐘金平 余瑛 廖振蓉 周茂華 黃剛 劉聯(lián)斌

[摘要]目的 探討敲減環(huán)氧合酶2（COX-2）對宮頸癌Hela細胞系生物學特性的影響及潛在機制。方法 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-COX-2的宮頸癌Hela細胞，通過CCK-8法檢測細胞增殖能力、克隆形成法檢測細胞克隆能力、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及Transwell檢測細胞遷移能力，觀察敲減COX-2表達后對細胞生物學功能的影響;通過Western Blot檢測p65、p-p65蛋白的表達。結(jié)果 轉(zhuǎn)染shRNA COX-2誘導p65及p-p65表達下調(diào)，并降低Hela細胞增殖、克隆形成及遷移能力。結(jié)論 下調(diào)COX-2可能通過調(diào)控NF-κB信號通路抑制宮頸癌Hela細胞的惡性生物學特性，從而抑制宮頸癌細胞的生長。

[關鍵詞]宮頸癌;Hela細胞;增殖;克隆形成;質(zhì)粒

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）7（b）-0004-05

Study on the effect and mechanism of NF-κB/COX-2 signaling pathway in cervical cancer

HUANG Jing1? ?PAN Yi-yun2? ?ZHONG Jin-ping1? ?YU Ying1? ?LIAO Zhen-rong1? ?ZHOU Mao-hua3? ?HUANG Gang3? ?LIU Lian-bin3▲

1. Department of Gynecological Tumor， Ganzhou Cancer Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou? ?341000， China; 2. Department of Chemotherapy， Ganzhou Cancer Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou? ?341000， China; 3. Department of Clinical Laboratory， Ganzhou Cancer Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou? ?341000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and potential mechanism of knocking down cyclooxygenase 2 （COX-2） on the biological characteristics of cervical cancer Hela cell line. Methods Cervical cancer Hela cells stably transfected with shRNA-COX-2 were constructed. Cell proliferation ability was detected by the CCK-8 method， cell cloning ability was detected by the clone formation method， apoptosis was detected by flow cytometry and cell migration ability was detected by Transwell. The effect of knocking down COX-2 expression on cell biological function was observed. The expression of p65 and p-p65 proteins was detected by Western Blot. Results Transfection of shRNA COX-2 induced the down-regulation of p65 and p-p65 expression， and reduced the proliferation， clonal formation and migration ability of Hela cells. Conclusion Down-regulation of COX-2 may inhibit the malignant biological characteristics of cervical cancer Hela cells by regulating the NF-κB signaling pathway， thereby inhibiting the growth of cervical cancer cells.

[Key words] Cervical cancer; Hela cells; Proliferation; Clonal formation; Plasmids

宮頸癌在全世界婦女惡性腫瘤中位居第二，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，年新發(fā)病人數(shù)約53萬，主要發(fā)生在發(fā)展中國家，西方發(fā)達國家宮頸癌發(fā)病率的下降得益于宮頸癌篩查的普及[1]。我國宮頸癌約以7.3%速率增長，由于篩查普及不足，多數(shù)患者確診時已屬于晚期，治療效果差，嚴重威脅生命健康[2]。早期發(fā)現(xiàn)及診斷是宮頸癌治療的關鍵，宮頸癌前病變及發(fā)生發(fā)展與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染密切相關[3]。炎癥因子核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX-2）在慢性炎癥和致癌通路中發(fā)揮重要作用[4]。研究指出下降NF-κB的DNA結(jié)合活性，減少COX-2蛋白表達可預防腫瘤的出現(xiàn)[5]。NF-κB、COX-2在宮頸癌的作用尚不明確，本研究旨在探討NF-κB/COX-2信號通路在宮頸癌中的作用及潛在機制，以期為宮頸癌的診斷和治療提供新的靶標，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1細胞與主要試劑

人宮頸癌Hela細胞系購自中科院上海細胞庫;慢病毒載體pLenR-GPH、病毒包裝輔助質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，Transfer Vector、293T細胞、大腸埃希菌菌株DH5α、dsDNA oligo購自Beyotime公司;限制性內(nèi)切酶購自Takara公司;胎牛血清（FBS）（批號：10270-106）、DMEM培養(yǎng)基（批號：C11995）購自美國Gbico公司;兔抗COX-2（批號：ab120295）購自美國Abcam公司;p65（批號：PA141573）、p-p65（批號：AF2006）購自Affinity公司;羊抗鼠/兔二抗（批號：F2761）購自美國Gibco公司;大提質(zhì)粒試劑盒購自美國Qiagen公司;LipofectaminTM 2000、胰蛋白酶、Trizol、SYBR購自美國Invitrogen公司;Annexin V-APC凋亡試劑盒購自美國eBioscience美國公司;流式細胞儀（Guava easyCyte HT）購自美國密理博公司。

1.2實驗分組

未轉(zhuǎn)染的Hela細胞作為對照（Hela組），轉(zhuǎn)染RNAi陰性對照Scramble的為NC組，此外3組shRNA COX-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela細胞分別為Sh1、Sh2及Sh3組，選擇其中敲減效率最高的為KD組。

1.3實驗方法

1.3.1 RNAi慢病毒載體構(gòu)建及慢病毒病毒轉(zhuǎn)染Hela細胞? 根據(jù)Genebank中COX-2序列（PTGS-2，NM_ 000963）為模板選擇3段靶序列：RNAi（1）5′-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3′、RNAi（2）5′-CCATTCT CCTTGAAAGGACTT-3′、RNAi（2）5′-CCGGAATTTTT GACAAGAA-3′。同時設計RNAi陰性對照Scramble序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。再根據(jù)以上3段序列設計寡核苷酸序列，該序列中插入Age I、EcoR I酶切位點，每對寡核苷酸序列退火后可形成短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中發(fā)夾環(huán)為19個堿基組成的小片段DNA雙鏈（表1）。聚合酶鏈式反應（PCR）鑒定陽性重組子后，送上海領科生物科技有限公司進行測序驗證。利用慢病毒載體包裝系統(tǒng)，然后共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后8 h然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液。取對數(shù)生長期的Hela細胞，以5×104cell/孔接種于6孔板中，置入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞融合度達到約30%后加入適宜量的病毒，12 h后觀察細胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基;如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基，感染3 d后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.3.2 Western Blot檢測蛋白表達? 收集慢病毒轉(zhuǎn)染96 h的Hela細胞，提取蛋白并測定濃度。恒流300 mA 150 min條件下濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。室溫下封閉1 h，加入TBST稀釋的COX-2（Abcam，1∶1000），p65（Abcam，1∶1000），p-p65（Abcam，1∶1000），4℃震蕩孵育過夜、TBST洗滌后，加入二抗室溫孵育2 h。充分洗滌后通過ECL化學發(fā)光進行曝光。采用Image J軟件計算灰度值。

1.3.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力? 取對數(shù)生長期的各組細胞制備成細胞懸液，計數(shù)細胞后種入96孔板細胞密度（約2000個/孔），每組3～5個負孔，共5個96孔板，連續(xù)檢測5 d，置入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前24 h，每孔加入10 μl的CCK-8，無需換液，注意盡量避免吹入氣泡，2～4 h后，振蕩器振蕩5～10 min，立即酶標儀450 nm檢測OD值，如果空中出現(xiàn)影響測量結(jié)果的氣泡，用燒熱的注射器針頭戳破，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計繪圖。

1.3.4 Transwell實驗檢測細胞遷移能力? Transwell小室上加入100 μl細胞懸液，下室加入600 μl 30%FBS培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細胞，空氣晾干，顯微鏡拍照。

1.3.5流式細胞儀檢測細胞凋亡? 收集懸浮細胞離心（2000 r/min離心5 min），用PBS洗滌細胞2次（2000 r/min離心5 min）收集1.5×105細胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞;加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應5～15 min;在1 h內(nèi)，進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.4統(tǒng)計學方法

采用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1構(gòu)建shRNA-COX-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela細胞

構(gòu)建三組shRNA-COX-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela細胞，Western Blot檢測各組COX-2的表達，結(jié)果顯示，Sh1、Sh2及Sh3組的COX-2表達均低于Hela組及NC組（P<0.05）;NC組與Hela組的COX-2比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.721，P>0.05）。根據(jù)敲減結(jié)果選擇Sh3組作為后續(xù)實驗細胞株（圖1）。

A：Hela細胞中COX-2蛋白表達的相對定量（與Hela組比較，*P<0.05，***P<0.001）;B：Western Blot檢測COX-2的相對表達

2.2敲減COX-2表達對Hela細胞增殖、克隆能力的影響

通過CCK-8法檢測敲減COX-2表達對Hela細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，生長72 h時KD組的增殖能力低于NC組，差異有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;生長96 h時差異更為明顯（P<0.05）（圖2A）;敲減COX-2表達后，KD組克隆細胞克隆形成能力低于NC組，差異有統(tǒng)計學差異（t=4.871，P<0.05）（圖2B）。

與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

A：CCK-8法檢測Hela細胞增殖;B：Hela細胞克隆形成率

2.3敲減COX-2表達對Hela細胞凋亡與遷移能力的影響

通過Transwell法檢測Hela細胞遷移能力，結(jié)果顯示，KD組的細胞遷移能力明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;NC組與Hela組的細胞遷移能力比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖3A）。通過Annexin V-PI法檢細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，敲減COX-2表達后，KD組與NC組的細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.997，P>0.05）（圖3B）。

2.4敲減COX-2表達對Hela細胞NF-κB通路的影響

Western Blot檢測NF-κB通路相關蛋白p65及p-p65的表達，當敲減Hela細胞COX-2表達后，KD組的COX-2、p65及p-p65表達均低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）（圖4）。

3討論

HPV持續(xù)感染是宮頸癌病變的重要原因，HPV DNA整合發(fā)生于宮頸病變早期，病毒致癌基因E6和E7活化，E2抑制內(nèi)源性E6基因表達并誘導宮頸細胞腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導的NK-κB激活[6]。NF-κB通路不僅是炎癥反應的關鍵信號，其異?；罨蓪е孪?、腸炎及多種腫瘤疾病的發(fā)生。此外，NF-κB通路在宿主的先天性和適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用[7]。早期病變時，NF-κB的激活抑制HPV持續(xù)感染狀態(tài)。在發(fā)展成高度上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的進程中，發(fā)揮協(xié)同作用促進病變[8-9]。實體瘤中NF-κB自身基因突變少見，但上游信號分子（如RAS、EGFR、PGF、HER2）的突變與活化NF-κB信號傳導有關[10]。NF-κB可以通過端粒酶調(diào)控增殖調(diào)節(jié)基因，如cyclin D1和c-myc，參與細胞惡性轉(zhuǎn)移、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）依賴性的血管生成和細胞永生基因的轉(zhuǎn)錄激活[11-12]。NF-κB激活還可以誘導激活胞嘧啶脫氨酶和APOBEC蛋白的表達，進而間接或直接參與宮頸癌的發(fā)生[13]。

COX-2作為前列腺素E2合成通路上的關鍵酶，在細胞凋亡、血管生成、免疫抑制及細胞遷移等過程中發(fā)揮重要作用，與宮頸癌發(fā)生進展密切相關[14]。COX-2的活性受到NF-κB的調(diào)節(jié)，在非小細胞癌中，NF-κB激活上調(diào)COX-2的表達[15]。前列腺素E2的抑制劑hyaluronan抑制白介素-1（IL-1）誘導的NF-κB活性，前列腺素E2表達和NF-κB活性相關[16]。NF-κB調(diào)控多種涉及轉(zhuǎn)移侵襲的基因表達，包括基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）和VEGF，MMP9參與基質(zhì)膠原降解進而影響了癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲，激活NF-κB信號可以誘導MMP9表達促進細胞侵襲[17-18]。最近研究顯示姜黃素可以通過下降NF-κB的DNA結(jié)合活性，減少COX-2蛋白來調(diào)控癌細胞的增殖與凋亡[19-20]。

本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達shRNA-COX-2的Hela細胞，敲減COX-2表達后觀察對Hela細胞生物學功能的影響，結(jié)果顯示，敲減COX-2后顯著抑制宮頸癌Hela細胞的增殖、克隆形成及遷移能力，但并未明顯影響Hela細胞凋亡能力，提示COX-2是Hela細胞惡性表型的關鍵基因。進一步探究COX-2的調(diào)控作用，抑制p65及p-p65表達，介導NF-κB信號通路發(fā)揮作用。但NF-κB/COX-2信號通路如何在宮頸癌Hela細胞中發(fā)揮關鍵作用，具體上下游調(diào)控機制有待于更深入的研究。

綜上所述，下調(diào)COX-2可能通過NF-κB通路抑制宮頸癌Hela細胞的增殖、克隆能力，并降低細胞的侵襲遷移作用，有利于深入了解其作用機制，為宮頸癌的精準個體化治療提供方向。

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（收稿日期：2020-01-16）