鐘佳佳，章超樺,2，高加龍,2，秦小明,2，曹文紅,2，鄭惠娜,2，林海生,2

三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物響應面優(yōu)化制備及醒酒活性

鐘佳佳1，章超樺1,2，高加龍1,2，秦小明1,2，曹文紅1,2，鄭惠娜1,2，林海生1,2

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江） // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋生物制品工程實驗室 // 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧 大連 116034）

【】研究三角帆蚌（）肉酶解產(chǎn)物的解酒防醉作用。以乙醇脫氫酶（ADH）激活率為指標，在單因素試驗基礎上響應面優(yōu)化三角帆蚌肉酶解工藝，制備三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物（Enzymatic hydrolysate from soft tissue of, EH），并測定EH對飲酒小鼠醉酒狀態(tài)、血液中乙醇濃度和肝臟ADH活力的影響，以評價其醒酒活性。選用中性蛋白酶為實驗用酶，三角帆蚌肉的最佳酶解條件為酶解時間2.0 h、酶解溫度50.0℃、料液比1∶3、加酶量1 000 U/g，在此條件下ADH激活率為18.30 %。小鼠攝入EH 300 mg/kg時，飲酒小鼠醉酒只數(shù)少，酒后90 min血乙醇濃度已降至8.80 mmol/L，肝臟ADH活力上升至7.64 U/mg。三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物能夠顯著激活肝臟ADH，降低血乙醇濃度，具有較好的醒酒功效和應用前景。

三角帆蚌；酶解；乙醇脫氫酶；醒酒功效

我國是世界珍珠主產(chǎn)國，其中淡水珍珠年產(chǎn)量高達2 000 t，占世界珍珠總產(chǎn)量的90%以上[1]。三角帆蚌（）是我國特有的優(yōu)質(zhì)淡水育珠蚌，主要分布于湖南、湖北、安徽、江蘇、浙江、江西等地江河湖泊中[2]。采珠后的三角帆蚌肉是主要副產(chǎn)物，每年可產(chǎn)生蚌肉高達9.0萬t[3-4]。采珠后的蚌肉肉質(zhì)粗韌、土腥味重，多用作飼料肥料或廢棄處理，造成其資源浪費和經(jīng)濟附加值低下，高產(chǎn)低值化成為我國淡水育珠蚌加工副產(chǎn)物面臨的主要問題[5]。蚌肉中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖及其它營養(yǎng)成分，并且富含鈣磷等礦物元素及其它微量元素，是開發(fā)營養(yǎng)功能性食品的優(yōu)質(zhì)原料[6-7]。目前，已發(fā)現(xiàn)三角帆蚌具有免疫調(diào)節(jié)[8]、抗腫瘤[9]、抗炎[10]、抗氧化[11]等生物活性。

酒精主要在乙醇脫氫酶（ADH）系統(tǒng)、微粒體乙醇氧化（MEOS）系統(tǒng)和過氧化氫酶（CAT）系統(tǒng)等三大酶系的參與下完成代謝，其中以ADH系統(tǒng)最為主要[12]。作為ADH系統(tǒng)中的關(guān)鍵代謝酶，ADH活性的提高是加快酒精代謝分解、降低血液中乙醇濃度的重要因素[13]。本研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣（）[14]、馬氏珠母貝（）[15]、企鵝珍珠貝（）[16]等海水貝類酶解產(chǎn)物均能夠激活小鼠肝臟ADH活力、降低血液中的乙醇濃度，具有顯著的醒酒功效。據(jù)《食療本草》和《本草綱目》記載，蚌肉主治解酒毒[17]，王常瞵等[18-19]報道了蚌肉肽及其肽-鋅螯合物具有保肝作用。為了研究三角帆蚌肉是否具有醒酒作用，本實驗以ADH激活率為指標，響應面優(yōu)化酶解工藝，并采用小鼠模型探究其酶解產(chǎn)物的醒酒功效，以期為三角帆蚌肉的深度開發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮三角帆蚌（），由廣東省汕頭市紹河珍珠有限責任公司提供；中性蛋白酶（2.6×104U/g）、堿性蛋白酶（2.5×104U/g），上海源葉生物科技有限公司；風味蛋白酶（1.9×104U/g）、木瓜蛋白酶（1.8×104U/g），南寧龐博生物工程有限公司；動物蛋白酶（4.0×104U/g）、復合蛋白酶（3.5×103U/g），諾維信生物技術(shù)有限公司；陽性藥物：“海王金樽”（以牡蠣提取物為主要功效成分，含有一定量的多肽及?；撬幔钲谑泻Ｍ踅】悼萍加邢薰?；白酒：56°紅星二鍋頭，北京紅星股份有限公司；Bradford蛋白濃度試劑盒，廣州鼎國生物技術(shù)有限公司；乙醇脫氫酶（300 U/mg），美國Sigma公司；血乙醇 (ALC)試劑盒和乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FDU-1100型真空冷凍干燥機：東京理化器械株式會社；Varioskan Flash全自動酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物的制備 取一定量的三角帆蚌肉，按一定的料液比（g/mL, 下同）加水，調(diào)至各酶最適pH值，均質(zhì)5 min，加入蛋白酶酶解，完成后100 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，以8 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，經(jīng)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥后貯存于-40 ℃冰箱以備用。

1.3.2 蛋白酶的篩選 按照1.3.1所述流程操作，選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、動物蛋白酶和復合蛋白酶，以ADH激活率為評價指標，加酶量1 000 U/g，料液比1∶3，以各蛋白酶最適pH值、溫度及酶活力等條件（見表1）進行實驗，考察不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對ADH激活率影響，選取最適蛋白酶。

表1 不同蛋白酶最適pH值、溫度、酶活力及供應商

1.3.3 單因素試驗 在選出最適蛋白酶的基礎上，以ADH激活率為評價指標，分別考察酶解溫度、酶解時間、料液比和加酶量對ADH活性的影響。酶解溫度：在酶解時間2.0 h、料液比1∶3、加酶量1 000 U/g條件下，酶解溫度分別為40、45、50、55和60 ℃。酶解時間：在酶解溫度50 ℃，料液比1∶3、加酶量1 000 U/g條件下，分別酶解1、2、3、4和5 h。料液比：在酶解溫度50 ℃，酶解時間2.0 h、加酶量1 000 U/g條件下，料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5。加酶量：在酶解溫度50 ℃、酶解時間2.0 h、料液比1∶3條件下，加酶量分別為600、800、1 000、1 200和1 400 U/g。

1.3.4 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，確定最適蛋白酶為中性蛋白酶，pH 7.0，據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，采用軟件Design-Expert V8.0.6.1，以酶解時間（）、酶解溫度（）、料液比（）和酶添加量（）為自變量，以ADH激活率為響應值（），設計4因素3水平如表2所示。

表2 響應面試驗因素水平

Table 2 Factors and levels in response surface experiment

1.3.5 體外ADH激活率 參照劉鵬[20]方法稍作修改，加入樣本后（蛋白質(zhì)量濃度1.25 ~ 3.25 mg/mL），用多功能酶標儀每15 s測定OD340 nm，連續(xù)測定10 min，計算EH對ADH的激活率。ADH激活率計算：

ADH激活率＝[樣品（2－1）－對照（2－1）]/對照（2－1），式中：1為15 s時的OD340 nm；2為10 min 15 s時的OD340 nm。

1.3.6 氨基酸組成分析 采用氨基酸自動分析儀按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.3.7 動物試驗

1.3.7.1 試驗動物 SPF級KM雄性小鼠210只，4周齡，體質(zhì)量（22 ± 2）g，試驗動物使用許可證號SYXK（粵）2019-0204，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學試驗動物研究所提供。飼養(yǎng)條件：溫度（23 ± 2）℃，濕度50 %~60 %，晝夜交替12 h∶12 h。

1.3.7.2 小鼠給酒量的確定 將50只SPF級KM雄性小鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為5組，每組10只。禁食不禁水12 h后稱質(zhì)量，按體積體質(zhì)量比分別灌胃10、12、14、16、18 mL/kg白酒（紅星二鍋頭），以“翻正反射試驗”觀察小鼠的酒后狀況[21]，記錄各組小鼠醉酒數(shù)和死亡數(shù)。

1.3.7.3 小鼠解酒和防醉試驗 將100只SPF級KM雄性小鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成10組：空白組、模型組、對照組（150 mg/kg、EH低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）和高（300 mg/kg）劑量組共6組，除空白組和模型組，其余4組設解酒組和防醉組，每組10只。試驗前禁食不禁水12 h，解酒組在灌胃白酒30 min后，分別灌胃一定量的“海王金樽”和EH（低、中和高劑量）；防醉組在灌胃白酒前30 min分別灌胃一定量的“海王金樽”和EH（低、中和高劑量）；空白組和模型組則分別給予等體積生理鹽水和白酒。其中，灌酒和灌胃用量分別為14 mL/kg和10 mL/kg。小鼠灌酒后立刻開始計時，記錄小鼠的翻正反射消失至恢復所需時間（即醉酒時間、睡眠時間）以及各組小鼠醉酒數(shù)。

1.3.7.4 小鼠血乙醇濃度和肝臟ADH活力的測定 將160只SPF級KM雄性小鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成6組：空白組、模型組、對照組、EH（低、中和高劑量組），每組30只。試驗前禁食不禁水12 h，各組小鼠在灌胃白酒30 min后，分別灌胃一定量的“海王金樽”和EH（低、中和高劑量），空白組僅給予等體積生理鹽水。其中，白酒、“海王金樽”、EH（低、中和高劑量）的灌胃劑量同1.3.7.3。于第30、60、90、120、150和180 min等不同時間段，分別從各組小鼠中各取5只進行摘眼球取血和破腹取肝臟，血液3000 r/min，4 ℃離心5 min后取血清，按試劑盒說明測定血乙醇濃度[22]；肝臟研磨后加入預冷的生理鹽水制成10 %肝組織勻漿，按試劑盒說明測定肝臟中ADH活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1可知，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對ADH活力的激活作用最大為16.78 %，因此選取中性蛋白酶為下一步實驗用酶，即為三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物（Enzymatic hydrolysate from soft tissue of, EH）。

2.2 單因素試驗

由圖2可知，當酶解溫度從40 ℃升至60 ℃，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對ADH的激活作用呈先上升后下降的趨勢，在50 ℃時有最大值為17.19 %，可見溫度對其ADH激活率的影響較大[23]。當酶解時間在1.0~2.0 h時，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對ADH的激活作用呈上升的趨勢。酶解2.0 h時，其ADH激活率達到最高值為17.95%；但酶解2.0 h后，其ADH激活率略有下降并趨于平穩(wěn)。此外，料液比對中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ADH激活率也存在影響[24]。當料液比1∶3時，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對ADH的激活作用達到最高值為17.82 %。隨著加酶量的增加，ADH激活率呈上升的趨勢，1 000 U/g后趨于平緩，但考慮酶的成本因素，故選取加酶量為1 000 U/g。

凡含不同字母表示差異具有統(tǒng)計意義（P < 0.05）

凡含不同字母表示差異具有統(tǒng)計意義（P < 0.05）

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面試驗設計與結(jié)果 在單因素試驗結(jié)果的基礎上，以ADH激活率（）為響應值，根據(jù)Box-Behnken中心設計原理，以時間（）、溫度（）、料液比（）和加酶量（）4個因素為自變量，利用Design-Expert V8.0.6.1軟件設計4因素3水平響應面試驗，如表3所示。

表3 EH的響應面試驗優(yōu)化設計與結(jié)果

2.3.2 回歸方程的建立與分析 采用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行二次多項式回歸擬合，建立回歸方程如下：

＝18.30－0.44－0.37＋0.026＋0.30－0.063＋0.44－0.19－0.21＋0.13－0.18－4.832－2.932－1.922－3.202，2＝0.984 1，回歸擬合與方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，模型值為61.79，值< 0.000 1，該模型回歸極顯著（＜0.001），失擬項不顯著（＞0.05），2＝0.984 1，2adj＝0.968 1，說明該模型實測值與預測值擬合良好，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，可用于分析和預測ADH激活率。該模型中一次項、項的＜0.05，說明酶解時間和酶解溫度對ADH激活率影響顯著；由檢驗得各因素貢獻率為：＞＞＞，即各因素對ADH激活率的影響順序為時間＞溫度＞加酶量＞料液比。

根據(jù)響應面尋優(yōu)分析方法對該回歸模型進行分析，得到最優(yōu)響應結(jié)果為酶解時間1.98 h、酶解溫度49.69 ℃、料液比1∶2.7和加酶量1 009.66 U/g，在此工藝條件下的ADH激活率最優(yōu)預測值達到18.33%?？紤]實際操作可行性，將工藝條件調(diào)整為酶解時間2.0 h、酶解溫度50.0 ℃、料液比1∶3和加酶量1 000 U/g，在此工藝條件下進行3次平行試驗，得到ADH激活率實測值為18.30%，預測值與實測值吻合度達99.97%，說明該模型響應值的實測值與回歸方程預測值吻合良好，該二次項回歸方程能夠準確預測ADH激活率。

2.4 EH的氨基酸組成

由表5可知，EH氨基酸組成全面，其必需氨基酸和疏水性氨基酸含量豐富，富含Glu（13.53 %）、Asp（10.73 %）和Lys（9.18 %），而游離態(tài)中以Leu（11.10 %）、Ala（9.50 %）和Lys（8.73 %）等較為豐富。研究表明，提高血液中Leu和Ala含量，可產(chǎn)生更多穩(wěn)定的輔酶NAD+，防止ADH競爭性失活，加快乙醇分解速率，最終經(jīng)三羧酸循環(huán)（TCA）生成H2O和CO2，從而降低血液中乙醇濃度[25-26]。此外，Glu殘基、Lys、Phe和Thr可提供電子或氫原子，使自由基失活或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為穩(wěn)定分子，在肽的醒酒活性方面起重要作用，而Pro和Arg也已證實對乙醇的代謝亦有促進作用[27-29]。

2.5 EH對小鼠的醒酒活性研究

2.5.1 小鼠給酒量的確定 由表6可知，給酒量為10 mL/kg時，醉酒率僅10.0 %；給酒量增至16 mL/kg時，小鼠開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。而當給酒量為14 mL/kg，小鼠的醉酒率達80.0 %且未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，選取14 mL/kg為下述試驗小鼠的灌酒劑量。

2.5.2 EH對醉酒小鼠的解酒與防醉效果 由表7可知，對照組和EH低、中、高劑量組中小鼠的醉酒時間均顯著高于模型組，其睡眠時間均顯著低于模型組（＜0.05）。與對照組相比，EH低、中、高劑量組中小鼠的醉酒時間明顯延長，尤以解酒組的效果最佳。此外，EH低、中、高劑量組中小鼠的睡眠時間雖明顯縮短，但無顯著性差異（＞0.05）。結(jié)果顯示，EH在酒后30 min攝入比酒前30 min攝入效果更佳，即EH解酒效果優(yōu)于防醉效果；且攝入100 mg/kg EH與150 mg/kg“海王金樽”效果持平。

表4 響應面模型回歸擬合與方差分析

注：2= 0.984 1；2adj= 0.968 1；*，＜0.05；***，＜0.001。

表5 EH的氨基酸組成

注：*必需氨基酸；#疏水性氨基酸。質(zhì)量分數(shù)：以干基計，每100 g EH中所含氨基酸克數(shù)。比率：各氨基酸質(zhì)量與氨基酸總量的比值。

Note: * Essential amino acid; # Hydrophobic amino acid. Mass fraction: g of amino acids per 100 g EH on a dry basis. Percentage: ratio of the mass of each amino acid to the total amount of amino acids.

表6 小鼠急性酒精中毒試驗結(jié)果

2.5.3 EH對醉酒小鼠血液中乙醇濃度的影響 圖3可見，酒后30 min時，模型組中小鼠的血乙醇濃度為18.59 mmol/L；90 min時，達最高濃度20.31 mmol/L；隨后血乙醇濃度逐漸下降，至180 min時，可降至14.69 mmol/L。此時血液中乙醇經(jīng)體內(nèi)血液循環(huán)和三羧酸循環(huán)（TCA）代謝分解[30]。至150 min時其下降速率趨于平緩，可見酒后前150 min為乙醇代謝分解的重要時間段。與模型組相比，對照組和EH低、中、高劑量組血乙醇濃度均顯著低于模型組（＜0.05）。90 min后，小鼠血乙醇濃度下降速度趨于平緩。其中，EH中、高劑量組至180 min時可降至接近小鼠的正常水平，二者無顯著性差異（＞0.05）。結(jié)果表明，EH可有效降低小鼠血乙醇濃度，尤以EH中、高劑量組效果較明顯。

表7 EH的解酒與防醉試驗及其對小鼠醉酒時間和睡眠時間的影響

注：凡肩標不同字母表示差異具有統(tǒng)計意義（P < 0.05）。

Note: Values with different superscript letters mean significance difference( P < 0.05 ).

圖3 EH對醉酒小鼠血液中乙醇濃度的影響

2.5.4 EH對醉酒小鼠肝臟中ADH活力的影響 酒精代謝的幾種途徑中尤以ADH主導的途徑最為重要[31]。肝臟中ADH活力是酒精代謝過程中直接影響其代謝速率的關(guān)鍵因素[32]。由圖4可知，在酒后前90 min，各組小鼠的肝臟ADH活力均在一定程度上較空白組有所提高（＜0.05），并且EH中、高劑量組均顯著高于模型組和對照組（＜0.05）。其中，EH高劑量組在90 min時達到最高值，為7.64 U/mg。隨后各組小鼠的肝臟ADH活力開始下降。至150 min時，EH高劑量組仍處于較高水平；至180 min時，對照組和EH低、中、高劑量組與空白組之間無顯著性差異（＞0.05）。結(jié)果表明，EH對小鼠肝臟中的ADH活力具有較好的激活作用，可在90 min時達至最佳激活效果，存在一定的量效關(guān)系及良好的持續(xù)激活作用。

凡含不同字母表示差異具有統(tǒng)計意義（P < 0.05）

3 結(jié)論

本研究以ADH激活率為指標，通過單因素結(jié)合響應面試驗優(yōu)化三角帆蚌肉酶解工藝，得到最佳酶解工藝條件：酶解時間2.0 h、酶解溫度50.0 ℃、料液比1∶3和加酶量1 000 U/g，在此工藝條件下測得ADH激活率為18.30 %。

對由上述優(yōu)化工藝條件制得的三角帆蚌肉酶解物（EH）進行相關(guān)醒酒活性的研究，結(jié)果表明EH能夠有效延長小鼠的醉酒時間、縮短其睡眠時間，具有一定的解酒防醉功效；其醒酒機理可能與其酒精代謝酶（ADH）的激活和血液中乙醇濃度的降低有關(guān)。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysate Preparation from Soft Tissue ofMeat by Response Surface Methodology and Its Anti-alcohol Activity

ZHONG Jia-jia1, ZHANG Chao-hua1,2, GAO Jia-long1,2, QIN Xiao-ming1,2, CAO Wen-hong1,2, ZHENG Hui-na1,2, LIN Hai-sheng1,2

（1,,(),,,,524088,; 2.,,116034,）

To study the anti-alcohol effect of the edible part of.The enzymatic hydrolysate (EH) from the soft tissue ofwas optimum prepared by single-factor design and response surface methodology based on the activation rate of alcohol dehydrogenase (ADH). Then the anti-alcohol effect of EH was evaluated by animal experiments that test the state of being drunk, the alcohol concentration in the blood and ADH activity in the liver of mice after drinking.Neutral protease was chosen to hydrolysis soft tissue of, the optimum conditions were hydrolysis for 2.0 h at 50.0 ℃ with solvent-to-material ratio 1∶3 and neutral protease 1000 U/g. The activation rate of ADH was 18.30 % under these conditions. Furthermore, for the mice with EH 300 mg/kg BW, the number of drunk mouse was less than the control group, the concentration of alcohol in blood of mice after drinking 90 min has decreased to 8.8 mmol/L and the ADH activity in liver of mice was increased to 7.6 U/mg.The enzymatic hydrolysate from the edible part ofcan activate the ADH activity and reduce the blood alcohol level significantly, which has a good anti-alcohol efficacy and application prospect.

;enzymolysis; alcohol dehydrogenase; anti-alcohol efficacy

TS254.9

A

1673-9159（2020）03-0099-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.013

2019-12-27

廣東省應用型科技研發(fā)專項資金項目（2016B020235002）；國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（CARS-49）；廣東普通高等學校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團隊項目（GDOU2016030503）；廣東海洋大學創(chuàng)新強校工程重大科研成果培育計劃（GDOU2017052606）

鐘佳佳（1994－），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品高值化加工與利用。E-mail: 2430827884@qq.com

章超樺（1956－），男，博士，教授，研究方向為水產(chǎn)品精深加工。E-mail: Zhangch2@139.com

高加龍（1983－），男，博士，講師，研究方向為水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。E-mail: garonne@126.com

鐘佳佳，章超樺，高加龍，等. 三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物響應面優(yōu)化制備及醒酒活性[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：99-107.