任佳佳，洪 廷，張 寧，黃翔鵠，李長玲

鹽度對波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)的影響及基因的克隆與表達分析

任佳佳，洪 廷，張 寧，黃翔鵠，李長玲

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518000；3. 廣東省藻類養(yǎng)殖及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

【】研究波吉卵囊藻（）在不同鹽度下葉綠素熒光參數(shù)的變化和編碼葉綠體D1蛋白的基因的表達特性。利用葉綠素熒光儀測定不同鹽度條件下波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)；利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)克隆獲取波吉卵囊藻基因序列，并進行生物信息學(xué)分析；利用實時熒光定量PCR（qPCR）方法分析基因在不同鹽度下的表達情況。高鹽（鹽度60）條件下PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（v/m）及PSII實際光化學(xué)量子效率（ΦPSⅡ）顯著下降（< 0.05）。克隆獲得1 314 bp波吉卵囊藻基因cDNA序列，包含1 062 bp開放閱讀框（ORF），預(yù)測編碼353個氨基酸，該蛋白屬于跨膜蛋白。qPCR結(jié)果表明，高鹽（鹽度60）條件下基因極顯著下調(diào)（< 0.01）。高鹽（鹽度60）顯著抑制波吉卵囊藻基因的表達和葉綠素熒光參數(shù)（v/m和ΦPSⅡ）的降低，表明波吉卵囊藻處于脅迫狀態(tài)；而鹽度10和30能促進基因的表達。

波吉卵囊藻; 鹽度; 葉綠素熒光參數(shù);基因

鹽脅迫是抑制植物光合作用效率的主要環(huán)境因子之一，目前對于鹽脅迫對植物光合作用影響的研究主要集中在光合色素[1,2]、PSⅡ功能[3]、PSⅠ電子傳遞[4,5]、類囊體膜[6,7]等方面，其中葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）活性的降低常是光合作用效率下降的主要原因。PSⅡ的活性可以用葉綠素熒光參數(shù)的變化來做指標。袁霞等[8]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對魚藤幼苗生長、光合和葉綠素熒光均有影響，鹽度越高，抑制越明顯。李惠芳[9]發(fā)現(xiàn)鹽度增加降低了扁稈藨草PSII反應(yīng)中心潛能。在低鹽和高鹽脅迫下，壇紫菜葉狀體葉綠素熒光參數(shù)隨時間增加明顯下降[10]。微藻中，對小球藻()和集胞藻()[11]、集胞藻屬(sp.) PCC6803[12]和PCC7492[13]的研究顯示鹽脅迫抑制了PSⅡ活性。鹽脅迫還會導(dǎo)致簡單角刺藻()和小球藻()的最大化學(xué)效率v/m和實際化學(xué)效率ΦPSⅡ值下降[14]。鄒曉娟[15]實驗發(fā)現(xiàn)海鹽逐級馴化顯著抑制了淡水鈍頂螺旋藻（）的光合作用，鹽脅迫降低PSⅡ的電子傳遞活性，損傷了螺旋藻的PSⅡ系統(tǒng)，使光合效率、電子傳遞效率和光飽和點均有下降趨勢。

基因是葉綠體基因，序列相對保守。其編碼的類囊體膜蛋白D1是PSⅡ反應(yīng)中心的核心蛋白之一，是光誘導(dǎo)失活的主要靶點[16]。在光照條件下D1蛋白會快速降解，且降解速度與光照強度成正比，因此植物為維持正常生理需求需要持續(xù)合成D1蛋白[17,18]。在脅迫環(huán)境下，D1蛋白的降解速率超過了其修復(fù)替代的速率，就會破壞PSⅡ反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)、抑制PSⅡ的活性[19]。在藍藻中，存在一個小的基因家族編碼各種不同的D1亞型，在這些生物中，對基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，通過調(diào)控翻譯對其表達進行微調(diào)[16]。而綠藻中基因的研究不多，目前報道集中于萊茵衣藻()[20]和鹽生杜氏藻()[21]。在萊茵衣藻葉綠體中，基因的表達受mRNA的強烈調(diào)控，尤其是在翻譯起始階段[22]。關(guān)于微藻基因在鹽脅迫條件下的表達模式研究較少，呂文賓等[23]研究發(fā)現(xiàn)高濃度NaCl(4.0 mol/L)能明顯抑制杜氏鹽藻基因的表達。Allakh等[24]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫（1.0 mol/L NaCl）會抑制集胞藻(sp)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

波吉卵囊藻（）是一種亞熱帶對蝦池塘中常見的優(yōu)勢綠藻，它能有效降低水體中氨氮和亞硝酸氮濃度[25]、抑制弧菌生長，吸附重金屬[26]，并且具有穩(wěn)定的種群增長速度和較強的抗逆性特點，可維持養(yǎng)殖系統(tǒng)的生態(tài)平衡，促進對蝦生長[27]，還可通過自然沉降實現(xiàn)快速濃縮，制成微生態(tài)制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控[28]。在實際培養(yǎng)中，筆者發(fā)現(xiàn)該藻可以耐受從0到60的鹽度，但是這一特性的機制尚未闡明。本實驗，通過測定波吉卵囊藻在不同鹽度下的葉綠素熒光參數(shù)變化，探究鹽度對波吉卵囊藻PSⅡ的影響，并通過其編碼D1蛋白的基因的克隆和表達特征分析，探討光合基因在波吉卵囊藻鹽度響應(yīng)和適應(yīng)中的作用，為進一步闡明波吉卵囊藻在逆境條件下的光合作用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

波吉卵囊藻由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻類資源開發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復(fù)實驗室提供。將正常培養(yǎng)條件下生長至對數(shù)生長期的波吉卵囊藻細胞沉降后離心濃縮去除原培養(yǎng)基，用滅菌水洗滌2次后，取30 mL藻泥接種到裝有800 mL不同鹽度(10，30，60)f/2培養(yǎng)基[29]的1 L錐形瓶中，接種密度為3.16×106cell/mL，其中鹽度30為正常培養(yǎng)條件，為對照組，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)的條件為溫度（25±1）℃，光暗比12 h∶12 h，照度1 500 lx，培養(yǎng)期間每天定時搖瓶3~4次。

分別取0、6、12、24、48 h及72 h各鹽度處理下的波吉卵囊藻1 mL測定其葉綠素熒光參數(shù)，取100 mL離心收集提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

1.2 試劑

Prime STAR Max DNA Polymerase、rTaq DNA聚合酶、Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、Amp、克隆載體pMD-18T等購自TAKARA公司，DEPC購自生工生物工程(上海)股份有限公司，RACE試劑盒購自Clontech公司，多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441 RNAprep Pure Plant Kit）購自天根生物科技有限公司，SYBR?Select Master Mix購自賽默飛世爾科技公司，Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞購自全式金公司。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素熒光參數(shù)測定 取不同鹽度處理不同培養(yǎng)時間的波吉卵囊藻，使用FMS-2脈沖調(diào)制熒光儀（Hansatech，英國）測量PSⅡ的最大光化學(xué)效率（v/m）和PSⅡ的實際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）。在光照下，當葉綠素熒光達到穩(wěn)態(tài)水平時，記錄穩(wěn)態(tài)熒光（s）和光適應(yīng)最大熒光m值，暗適應(yīng)30 min后測定ΦPSⅡ＝1-（s/m）·（v/m）。

1.3.2 總RNA提取與cDNA合成 波吉卵囊藻總RNA提取參照天根多糖多酚試劑盒說明書，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性，NanoDrop ND1000紫外分光光度計測量RNA濃度并分析純度。5′-RACE和3′-RACE模板的制備參照SMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司）的說明書。

1.3.3 cDNA全長序列獲得 從波吉卵囊藻二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GeneBank登錄號：SRR10662504)中獲得注釋為的unigene序列，并設(shè)計特異性引物（表1）進行中間片段驗證。參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH）說明書，以波吉卵囊藻高質(zhì)量總RNA為模板，分別反轉(zhuǎn)錄合成5′-RACE-Ready cDNA以及3′-RACE-Ready cDNA，并分別以此為模板，以根據(jù)驗證序列設(shè)計的RACE引物（表1）依次進行Touchdown PCR和Nested PCR擴增獲得5′和3′末端cDNA序列。

表1 引物名稱和序列

1.3.4 生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN軟件對已驗證序列和RACE序列進行重疊拼接，獲得基因的cDNA完整序列。采用NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列同源性比對和相似性分析；使用NCBI在線BLASTp進行氨基酸同源比對分析；運用ExPASy Proteomics Server（http://web.expasy.org/protparam/）推導(dǎo)氨基酸序列，確定開放閱讀框（ORF）、分子質(zhì)量計算值和理論等電點（pI）預(yù)測等；通過SignalP 4.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測信號肽序列；應(yīng)用TMHMM Server 2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；SoftBerry-Psite（http://linux1.softberry.com/berry. phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc）預(yù)測氨基酸序列中的功能位點分布；采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto-mat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線網(wǎng)站預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（http://www. swissmodel.expasy.org/）程序進行三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建；利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在線網(wǎng)站進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；MEGA X軟件，以鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，用自展法（Bootstrap）檢驗系統(tǒng)樹，自展重復(fù)次數(shù)設(shè)為1 000次。

1.3.5 實時熒光定量PCR 通過qPCR檢測基因在不同鹽度中不同培養(yǎng)時間的表達情況，作為內(nèi)參，每組樣品進行3次技術(shù)重復(fù)，每個處理進行4次生物學(xué)重復(fù)。各處理組相對表達量用2-△△CT法計算。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運用SPSS 18.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Duncan’s多重比較對均值進行差異顯著性檢驗，< 0.05表示有顯著性差異，< 0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽度下波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)變化

不同鹽度下波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)的變化如圖1所示。從圖1a可以看到波吉卵囊藻在低鹽（鹽度10）和正常鹽度（鹽度30）的v/m值無顯著差異，而高鹽組（鹽度60）v/m值顯著降低（< 0.05），說明PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率在高鹽條件下受到抑制顯著下降，波吉卵囊藻在此鹽度下受到脅迫。從圖1b可以看到波吉卵囊藻在鹽度10和30的ΦPSⅡ值無顯著差異，而高鹽組（鹽度60）ΦPSⅡ值顯著降低（< 0.05），表明高鹽會降低電子傳遞的量子效率。

*表示有顯著差異（< 0.05）

a. PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（vm）；

b. PSⅡ?qū)嶋H電子傳遞量子效率（ΦPSⅡ）

* means there is significant difference（< 0.05）

a. The maximum photochemical quantum yield (v/m) of PS II；

b. The quantum efficiency of electron transfer (ΦPSⅡ) of PS II

圖1 不同鹽度下波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)的變化

Fig. 1 Changes of chlorophyll fluorescence parameters ofunder different salinity

2.2 PsbA基因的cDNA克隆和序列分析

通過RACE技術(shù)擴增獲得cDNA序列為1 314 bp，ORF為1 062 bp，編碼353個氨基酸。運用ExPASy Proteomics Server在線預(yù)測編碼的D1蛋白分子質(zhì)量約為38.87 ku，理論等電點為5.10。不穩(wěn)定系數(shù)35.89，屬于穩(wěn)定蛋白。脂溶性系數(shù)（Aliphatic index）為93.99，總的親水性平均系數(shù)為0.355，為非親水蛋白。酸性氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)為27，堿性氨基酸（Arg + Lys）總數(shù)為14，N末端是蛋氨酸（Met）。利用Signal P 4.0 Server程序?qū)︻A(yù)測D1蛋白的氨基酸序列進行信號肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)不存在信號肽。TMHMM Server v. 2.0程序預(yù)測有5個跨膜區(qū)（圖2）。Soft Berry-Psite（predict protein）程序預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列含有3個N-糖基化位點，1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，1個蛋白激酶C磷酸化位點，7個酪蛋白激酶II磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，6個N-肉豆蔻?；稽c，1個Prenyl基團結(jié)合位點，5個微體C-末端靶信號位點以及1個光合反應(yīng)中心蛋白特征位點。

圖2 波吉卵囊藻D1蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3 蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

預(yù)測的D1蛋白空間結(jié)構(gòu)見圖3a。由圖3a可知編碼該蛋白的353個氨基酸殘基中，包含40.51 %的α螺旋（藍色h）、23.23 %的延伸鏈（紅色e）、7.08 %的β轉(zhuǎn)角（綠色t）以及29.18 %的無規(guī)則卷曲（黃色c），其中α螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件。通過構(gòu)建的蛋白三維立體結(jié)構(gòu)模型如圖3b。

圖3 D1波吉卵囊藻D1蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測及系統(tǒng)進化分析

通過BLASTp對波吉卵囊藻的D1蛋白序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)波吉卵囊藻的D1蛋白與其他藻類物種同源性較高，其中與共球藻（）、絲藻（）及小球藻（）氨基酸序列同源性高達97 %。運用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme_)在線軟件將波吉卵囊藻基因編碼的蛋白序列與其他植物的D1蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測（圖4），結(jié)果顯示波吉卵囊藻和葡萄藻()、念珠藻（CCNUN1）的保守結(jié)構(gòu)域匹配度最為接近。用MEGA X軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建這些物種的系統(tǒng)進化樹（圖5），顯示波吉卵囊藻和葡萄藻()聚為一簇。

圖4 波吉卵囊藻PsbA基因編碼蛋白與其他物種D1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖5 波吉卵囊藻PsbA基因編碼蛋白與其他物種D1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.5 PsbA基因在不同鹽度下差異表達

由圖6可知，鹽度對波吉卵囊藻基因表達有極顯著影響（< 0.01）。培養(yǎng)72 h，各鹽度組基因的表達均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。在培養(yǎng)前24 h，各鹽度組基因表達量均較低，低鹽組（鹽度10）基因表達顯著低于對照組（鹽度30）和高鹽組（鹽度60）（< 0.05），高鹽組和對照組差異不顯著。各鹽度組在48 h表達極顯著增加（< 0.01）至最高，其中，低鹽組表達量顯著高于對照組（< 0.05），72 h雖然有下降，但與對照組沒有顯著差異，表明鹽度10會促進波吉卵囊藻的表達。而高鹽組表達48 h時顯著低于對照組（< 0.05）且在72 h極顯著下降了59 %，表明波吉卵囊藻的表達在高鹽條件下受到抑制。綜上，中、低鹽度會促進波吉卵囊藻基因的表達，而高鹽度會抑制其表達。

圖6 不同鹽濃度下波吉卵囊藻PsbA基因的表達

3 討論

3.1 鹽度對波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

鹽度會通過多條途徑來影響植物光合作用，例如離子脅迫和滲透脅迫，影響光合電子傳遞效率和CO2同化作用[30]。歐陽葉新等[31]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫條件會阻礙光能從魚腥藻PSⅡ向PSI傳遞，為避免光合組織受到損傷，其PSⅡ反應(yīng)中心開放部分的比例縮小，用于光合作用電子傳遞的份額減少，以熱或其它形式耗散的光能增加。此外，鹽脅迫會阻止植物細胞同化力(NADPH，ATP)的形成，影響對碳的固定與同化[32]。

含氧光合生物體的生理狀態(tài)可直接通過葉綠素熒光參數(shù)反映[33]，對研究其在不同環(huán)境條件下的光合效率具有高度敏感性、無損性和可靠性[34-35]。通過對葉綠素熒光參數(shù)指標的測定，可以有力揭示脅迫條件對微藻生長和代謝的影響。由于光照下的非生物和生物脅迫通常會導(dǎo)致植物的v/m降低，因此v/m測量成為一種簡單而快速的脅迫監(jiān)測方法[36-37]。畢永紅等[38]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)狀念珠藻()v/m值隨NaC1濃度的增加逐漸降低，在對魚腥藻(sp.)的研究中也得到了相似結(jié)果[39]。王帥等[30]發(fā)現(xiàn)在鹽度過低(20)和過高(110)的脅迫條件下，鹽生杜氏藻PSⅡ的熒光指標(v/m、ΦPSⅡ、v/o和rETR)均會顯著降低。

ΦPSⅡ是PSⅡ?qū)嶋H電子傳遞的量子效率，反映電子在PSⅡ與PSⅠ的傳遞情況[40]。實際光化學(xué)量子效率（ΦPSⅡ）提供了一種快速方法來確定PSⅡ在不同光照和其他環(huán)境條件下的運行效率[36]，它的偏差揭示了PSⅡ光化學(xué)的可逆調(diào)節(jié)，而不是對光合系統(tǒng)的不可逆破壞，因此常被用作評估藻類對環(huán)境壓力反應(yīng)的良好生態(tài)生理指標[41]。蛋白核小球藻820的v/m、ΦPSⅡ、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP) 隨鹽度升高下降，高鹽抑制了小球藻PSII的運行效率[42]。高鹽和低鹽脅迫下，三角褐指藻()、纖細角毛藻()、等鞭藻3011(3011)和等鞭藻8701 (8701) 的v/m、ΦPSⅡ均明顯降低，且在一定鹽度范圍內(nèi)，這些參數(shù)與鹽度呈顯著相關(guān)關(guān)系[43]。高鹽脅迫使塔胞藻的v/m和ΦPSⅡ明顯降低[44]。

本研究中波吉卵囊藻在高鹽（鹽度60）條件下v/m和ΦPSⅡ的顯著降低且低于對照組，這與大部分微藻在鹽脅迫下的結(jié)果一致，表明波吉卵囊藻在鹽度60時已處于脅迫狀態(tài)，鹽脅迫會使PSII反應(yīng)中心受損，抑制光合作用的原初反應(yīng)，阻礙光合電子傳遞的過程。而波吉卵囊藻在低鹽（鹽度10）條件下的v/m和ΦPSⅡ與對照組無顯著差異，說明波吉卵囊藻在此鹽度下可以正常進行光合作用生長。我國對蝦養(yǎng)殖池塘鹽度變化較大，在海南省淡水缺少的地區(qū)蝦池鹽度一般在25 ~ 30，在廣東湛江等地區(qū)對蝦高位池的鹽度范圍一般在10 ~ 34[45]。當遇到暴雨等惡劣天氣，蝦池鹽度甚至?xí)蠓陆礫46]，而波吉卵囊藻在低鹽條件下能進行正常光合與生長這一優(yōu)勢，為其更好適應(yīng)與調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水質(zhì)提供了依據(jù)。

3.2 波吉卵囊藻PsbA的克隆與序列分析

在高等植物葉綠體蛋白中，基因編碼的類囊體膜蛋白D1蛋白一直受到重視，而低等藻類的基因研究相對較晚。序列高度保守是葉綠體基因組的特性之一，同樣，葉綠體基因也遵循這一特性?；蚓幋a區(qū)的核苷酸序列在雙子葉植物之間的同源性超過90%，而其編碼的氨基酸序列保守性更高，如水稻、煙草、大豆等植物之間超過98%，藻類等低等植物的同源性略低一些，一般為84% ~ 90%[47]。由于基因高度保守，因此廣泛用于較高水平如屬以上水平的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的比較[48]。本研究克隆獲得卵囊藻完整ORF區(qū)，并推導(dǎo)出編碼D1蛋白的氨基酸序列。分析顯示，卵囊藻D1蛋白序列與其他綠藻之間的同源性極高（95% ~ 97%），絕大多數(shù)部分氨基酸和功能位點保守，通過構(gòu)建的蛋白三維立體結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn)該蛋白與衣藻C2S2型PSⅡ的D1蛋白以及豌豆C2S2M2型PSⅡ相似性極高。該結(jié)果為研究卵囊藻基因上游啟動子序列及該基因的表達調(diào)控提供基礎(chǔ)，有利于闡明卵囊藻在生長過程中葉綠體轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其光合作用的機制。

3.3 鹽度對波吉卵囊藻PsbA表達的影響

微藻的表達調(diào)控等研究在藍藻中最多，藍藻屬于多基因家族，一般有3個以上，這些不同的對環(huán)境因子變化的響應(yīng)也不同。如Summerfield等[49]發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境因子會使集胞藻中表達豐度上調(diào)。Kós等[50]發(fā)現(xiàn)細長聚球藻的基因在不同光照強度下優(yōu)勢表達不同，如光強增強時其1優(yōu)勢表達會轉(zhuǎn)變?yōu)?占據(jù)優(yōu)勢。而集胞藻(sp.)在鹽脅迫時通過抑制等光誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制的活性來抑制PSII的修復(fù)[24]。目前，在綠藻中有關(guān)的表達調(diào)控研究較少，孫雪等[51]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度光合抑制劑DCMU會降低自養(yǎng)小球藻轉(zhuǎn)錄活性至未添加組的40% ~ 59%，但卻不同程度促進了異養(yǎng)小球藻的轉(zhuǎn)錄表達，表明的表達調(diào)控在自養(yǎng)和異養(yǎng)微藻中存在著不同的響應(yīng)機制。

本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)不同鹽度會對波吉卵囊藻表達造成影響。與對照相比，低鹽下波吉卵囊藻的表達顯著增加而高鹽下該基因表達顯著下降，表明鹽度能夠?qū)Σ涯以宓谋磉_產(chǎn)生雙重效應(yīng)。在培養(yǎng)前24 h，各鹽度下波吉卵囊藻的表達豐度極顯著低于培養(yǎng)后期，推測可能是接種后藻細胞尚處于恢復(fù)期，植物生長未達最適狀態(tài)，基因表達量低。培養(yǎng)達到48 h時，波吉卵囊藻恢復(fù)最佳生長狀態(tài)，各鹽度組的表達均大幅提高其中，低鹽（鹽度10）條件下的表達量達到最高，用于光合作用電子傳遞（ΦPSⅡ）份額較高（圖1），推測此時低鹽濃度對波吉卵囊藻基因刺激最大，以合成更多D1、促進PSⅡ修復(fù)來保護自身正常生存，是波吉卵囊藻對低鹽環(huán)境的適應(yīng)。高鹽組（鹽度60）表達雖在48 h達到最高值但極顯著低于其他鹽度組，且在72 h顯著下調(diào)，表明高鹽開始抑制波吉卵囊藻的轉(zhuǎn)錄，這與高鹽條件下對杜氏鹽藻[23]和集胞藻屬[24]基因的表達受到抑制的結(jié)果一致。而高鹽對波吉卵囊藻表達抑制的原理還尚未探明。在衣藻的葉綠體中，表達的調(diào)節(jié)發(fā)生在mRNA加工和翻譯的水平，而在高等植物中翻譯伸長是表達的主要決定因素[52]。此外，D1降解是高等植物的葉綠體中有效合成D1的前提，而D1蛋白的磷酸化對D1降解的調(diào)節(jié)具有重要影響[16]。有研究表明[53]，玉米葉片S1結(jié)構(gòu)域蛋白SRRP1在黑暗中會抑制核糖體結(jié)合。

植物光合作用是由2個光系統(tǒng)PSll和PSl協(xié)作完成。PSⅡ的核心蛋白之一的D1蛋白是由葉綠體基因編碼，葉綠體70S核糖體翻譯合成前體再加工結(jié)合色素等輔助因子，最后組裝到PSⅡ顆粒中才能發(fā)揮正常生理功能[54]。因此當植物光合基因的表達受到鹽濃度影響，就會進一步限制其光合作用效率。在高鹽條件下波吉卵囊藻表達量的下調(diào)與葉綠素熒光參數(shù)的下降（圖1）相吻合，表明鹽度脅迫條件通過抑制波吉卵囊藻的表達，進而抑制了D1蛋白的合成以及影響了PSⅡ的修復(fù)。

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Effects of Salinity on chlorophyll fluorescence parameters and Cloning and Characterization ofGene in

REN Jia-jia, HONG Ting, ZHANG Ning, HUANG Xiang-hu, LI Chang-ling

（1.,,524088,；2.518000；3.524025）

To determine the effects of salinity on the changes of chlorophyll fluorescence parameters and expression characteristics of thegene encoding the chloroplast D1 protein of.Chlorophyll fluorescence meter was used to measure the chlorophyll fluorescence parameters ofunder different salinity conditions. The rapid amplification of cDNA ends technology (RACE) was used to clone and obtaingene sequence. Its sequence characteristics were analyzed by bioinformatics. Real-time quantitative PCR (qPCR) was used to analyze the expression ofunder different salinity conditions.Under high salinity (salinity 60), the maximum photochemical quantum yield (v/m) of PSⅡ and the quantum efficiency of electron transfer (ΦPSⅡ) of PSⅡ decreased significantly (< 0.05). The cDNA sequence ofwas 1314 bp in length. It contained an open reading frame (ORF) of 1062 bp and was predicted to encode a transmembrane protein composed of 353 amino acids. qPCR results showed that thewas significantly down-regulated under high salinity conditions (salinity 60) (< 0.01).Thegene expression and chlorophyll fluorescence parameters (v/mand ΦPSⅡ) were significantly inhibited at high salinity (salinity 60) whenwas in stress; however, the salinity of 10 and 30 could promote expression ofgene.

; salinity; chlorophyll fluorescence parameters;

S917.3

A

1673-9159（2020）03-0030-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.005

2020-01-25

活性微藻制品產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)的研究和示范(KY20180112)

任佳佳（1995－），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail: 570220648@qq.com

張寧（1986－），女，博士，講師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與分子生物學(xué)研究。E-mail: zhangn@gdou.edu.cn

任佳佳，洪廷，張寧，等. 鹽度對波吉卵囊藻葉綠素熒光參數(shù)的影響及PsbA基因的克隆與表達分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（3）：30-39.

（責任編輯：劉嶺）