魯 蓉，王 昊，王福玲，許慧琳，楊 波

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)常因上呼吸道感染、寒冷天氣、塵螨和油煙引起或加重，這種咳嗽經(jīng)常持續(xù)或復(fù)發(fā)一個(gè)月以上，屬于一種慢性氣道炎癥性疾病，涉及到了多種炎癥細(xì)胞的參與，而過(guò)敏性炎癥是CVA的基本發(fā)病機(jī)制[1].目前，激素是CVA的主要治療手段，但其長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)較多，所以對(duì)于CVA的治療可以考慮中醫(yī)的療法，并且多年來(lái)中醫(yī)在CVA的治療方面也積累了大量經(jīng)驗(yàn)，如黃芪作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，在哮喘的防治中發(fā)揮著重要作用.黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是黃芪的提取物，研究表明APS在CVA動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗炎作用，并且既往研究發(fā)現(xiàn)APS可抑制CVA小鼠氣道炎癥，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞因子表達(dá)[2].

1 實(shí)驗(yàn)試劑儀器及材料

氫氧化鋁(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司)；卵清蛋白OVA(上海滬宇生物科技有限公司)；丙酮(廣州化學(xué)試劑二廠)；伊紅(廣州化學(xué)試劑二廠)；602C壓縮空氣式霧化器(丹陽(yáng)市恒寧醫(yī)療器械有限公司)；ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀(成都泰盟科技有限公司)；TGL-10K臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)療儀器廠)；DMM-100C光學(xué)顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)；ICR小鼠(長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)；孟魯司特鈉(上?？祈樕镉邢薰?；小鼠(Mouse)腫瘤壞死因子ELISA檢測(cè)試劑盒(杭州誠(chéng)維生物科技有限公司)；小鼠(Mouse)白細(xì)胞介素2(IL-2)ELISA檢測(cè)試劑盒(杭州誠(chéng)維生物科技有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型建立及給藥

選取18只小鼠(雌雄小鼠各半)，隨機(jī)抽取6只作為空白對(duì)照組[3]，其余各組予小鼠腹腔注射新配制的OVA致敏液0.2 mL致敏，1次/d，連續(xù)15 d；第15～20天將小鼠置于透明霧化吸入箱中，霧化吸入1%OVA溶液激發(fā)，第21天霧化吸入2%OVA溶液激發(fā)，小鼠自然吸入，30 min/次，1次/d.將造模成功的小鼠隨機(jī)分為CVA模型組和黃芪多糖組，黃芪多糖組動(dòng)物灌胃給藥200 mg/(kg·d)，空白對(duì)照組和CVA模型組小鼠采用等量的生理鹽水灌胃給藥，連續(xù)一周.

2.1.1 OVA致敏液配制

先量筒量取生理鹽水5 mL，加入氫氧化鋁200 mg充分混懸，制成4%的氫氧化鋁凝膠液；再取2.5 mL的生理鹽水，加入1.5 mg OVA充分溶解，最后取氫氧化鋁凝膠液2.5 mL與之充分混懸作為致敏液，即時(shí)使用[4].

2.1.2 1%OVA霧化液配制

首先用電子天平稱取1 mg OVA，在與100 mL生理鹽水混合后，用恒溫磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枋怪芙?，制?%OVA霧化液.即時(shí)使用[5].

2.1.3 2%OVA霧化液配制

首先用電子天平稱取2 mg OVA，方法同上.即時(shí)使用[5].

2.2 觀測(cè)CVA模型小鼠整體指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)第21天，觀察10 min內(nèi)小鼠抓鼻次數(shù)以及哮喘發(fā)作癥狀.實(shí)驗(yàn)第20～21天測(cè)定小鼠24 h 內(nèi)的進(jìn)食量與飲水量；實(shí)驗(yàn)第21天下午6點(diǎn)測(cè)定小鼠自主活動(dòng)，開啟小鼠自主活動(dòng)儀，將小鼠放入并適應(yīng)3 min后，測(cè)定5 min的活動(dòng)次數(shù)與抬頭(站立)次數(shù)[6].

2.3 測(cè)定CVA模型小鼠離體指標(biāo)

2.3.1 外周血的收集

在實(shí)驗(yàn)的第22天，處死小鼠后眼球取血.靜置，離心，取上清于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆肹7].

2.3.2 CVA模型小鼠肺濕干重

小鼠經(jīng)眼球取血后仰臥，將其四肢及頭固定，暴露其胸腔，結(jié)扎右肺，取右肺下葉，稱小鼠肺濕重，然后再置于56 ℃烤箱中烘烤72 h后稱其肺干重，最后計(jì)算其肺濕干重比值[6].

2.3.3 外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

1)用100 μL冷的 PBS稀釋外周血細(xì)胞沉淀物，取30 μL用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)其細(xì)胞總數(shù).

2)取 50 μL細(xì)胞沉渣涂片，干燥固定，經(jīng) Wright′s(瑞氏)染色后，顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞(Leu)，然后按形態(tài)學(xué)特征[8]將細(xì)胞依次分為嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)、中性粒細(xì)胞(Neu)、淋巴細(xì)胞(Lym)及單核細(xì)胞(Mon).

2.3.4 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中TNF-α和IL-2的質(zhì)量濃度

按試劑盒說(shuō)明書[9]測(cè)定小鼠血清中TNF-α和IL-2的質(zhì)量濃度.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠進(jìn)食量及飲水量的比較

如表1所示，模型組與空白組比較，模型組小鼠的進(jìn)食量及飲水量均減少了.與模型組相比，黃芪多糖組小鼠進(jìn)食量有所減少，而飲水量增加了，但無(wú)顯著性差異(P>0.05).

表1 黃芪多糖對(duì)哮喘小鼠進(jìn)食量及飲水量的影響

3.2 各組鼠自主活動(dòng)及哮喘行為學(xué)的比較

如表2所示，模型組與空白組相比小鼠的活動(dòng)次數(shù)及抓鼻次數(shù)均有明顯的增加，存在極顯著性差異(P<0.01).與模型組相比黃芪多糖組小鼠的活動(dòng)次數(shù)及抓鼻次數(shù)均減少，但無(wú)顯著性差異(P>0.05).

表2 黃芪多糖對(duì)哮喘小鼠自主活動(dòng)及哮喘行為學(xué)的影響

3.3 各組小鼠肺濕干重的比較

如表3所示，模型組與空白組相比小鼠肺濕重、肺干重均有明顯增加，存在極顯著性差異(P<0.01)，且模型組小鼠肺濕干重比值有明顯升高，存在顯著性差異(P<0.05).與模型組比較，黃芪多糖組小鼠肺濕重、肺干重及肺濕干重比值均降低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05).

表3 黃芪多糖對(duì)哮喘小鼠肺濕干重的影響

3.4 各組小鼠血液中白細(xì)胞的比較

如表4所示，模型組與空白組相比小鼠白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞均有明顯增加，存在極顯著性差異(P<0.01).與模型組比較，黃芪多糖組小鼠白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞均減少，且嗜酸性粒細(xì)胞減少明顯，存在顯著性差異(P<0.05).

表4 黃芪多糖對(duì)哮喘小鼠白細(xì)胞的影響

3.5 各組小鼠血液中單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的比較

如表5所示，與空白組相比模型組小鼠單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞均有明顯增加，存在極顯著性差異(P<0.01).與模型組比較，黃芪多糖組小鼠單核細(xì)胞減少明顯，存在顯著性差異(P<0.05)，且黃芪多糖組小鼠淋巴細(xì)胞也減少，但無(wú)顯著性差異(P>0.05).

表5 黃芪多糖對(duì)哮喘小鼠單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的影響(x±S，n=6)

3.6 各組小鼠血清中IL-2、TNF-α質(zhì)量濃度的比較

如表6所示，模型組與空白組比較，小鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度有明顯降低，存在顯著性差異(P<0.05)，而TNF-α質(zhì)量濃度升高.與模型組小鼠比較，黃芪多糖組小鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度有明顯升高，存在極顯著性差異(P<0.01)，而血清中TNF-α質(zhì)量濃度降低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05).

表6 黃芪多糖對(duì)小鼠血清中IL-2、TNF-α質(zhì)量濃度的影響(x±S，n=6)

4 討 論

本文通過(guò)建立小鼠模型的方式證實(shí)了黃芪多糖具有良好治療小鼠CVA的作用.實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠肺組織的病理變化與哮喘氣道炎癥的基本病理特征一致，說(shuō)明OVA致敏和氣霧劑吸入刺激法制備小鼠CVA模型是成功的[10].其中,給藥組小鼠氣道炎癥和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度低于模型組, 且APS組的效果更明顯，從此結(jié)果可以看出APS具有良好的抗炎作用；與模型組比較，APS組血清中TNF-α的表達(dá)降低，而IL-2的表達(dá)增高，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)APS具有良好的抗炎效果，其抗炎機(jī)制可能與血清中TNF-α及IL-2表達(dá)有關(guān)[11].