李冬靜，李欣宇，楊 陽，封國溧，王志翀，張文君

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)是一種來源于川芎中的有效活性單體成分生物堿，對腦血管疾病有多種保護(hù)和治療作用[1]，在腦中風(fēng)疾病中應(yīng)用甚廣[2].目前市售劑型主要有片劑、膠囊劑和注射劑，其中注射給藥臨床上使用最多[3-4].川芎嗪具有一定脂溶性，可透過血腦屏障，但其水溶性差，口服制劑在體內(nèi)難以吸收，導(dǎo)致生物利用度低，為達(dá)到治療濃度，須頻繁給藥易致蓄積川芎嗪濃度超過治療窗甚至中毒，這一問題極大地限制了其開發(fā)應(yīng)用.

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為一類具有良好生物降解性和生物相容性的納米載體材料，該材料進(jìn)入人體后降解為人體內(nèi)存在的乳酸和羥基乙酸，對人體無害已廣泛應(yīng)用于載藥納米粒的制備[5-6].

聚氰基丙烯酸正丁酯(polybutylcyanoacrylate, BCA)由于其生物相容性好、可降解性、釋藥持續(xù)性并有良好的控制釋放、靶向投遞等功能而備受重視[7-9].目前BCA作為載體將藥物送入腦內(nèi)，取得明顯效果，是目前藥物傳輸系統(tǒng)研究中的熱點.因此，本實驗以BCA-PLGA為載體，采用改良的乳化溶劑揮發(fā)法[10-11]和界面縮聚法[12-13]制備BCA-PLGA雙包載川芎嗪納米粒[14-15]，采用單因素試驗考察處方及因素，正交優(yōu)化確定制備工藝，以期制備包封率、載藥量高的BCA-PLGA納米粒，為研究川芎嗪納米給藥系統(tǒng)研究提供參考.

1 儀器和試藥

1.1 儀器

紫外分光光度儀(UV-2021 PC型紫外可見分光光度計)；激光粒徑測定儀(馬爾文NanoZS 90，英國)；LE204E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；79-2型雙向磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司).

1.2 藥品

川芎嗪對照品(中國藥品生物制品檢定所)；川芎嗪(上海源葉生物科技有限公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(α-BCA，國藥集團(tuán))；PLGA(50/50，相對分子質(zhì)量20 000，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；聚乙烯醇(上海美夢佳化工科技有限公司)；甲醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(天津市協(xié)和昊鵬色譜科技公司)

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 TMP-BCA-PLGA納米粒的制備工藝

TMP納米粒的制備采用改良的自乳化溶劑揮發(fā)法結(jié)合界面縮聚法.取處方量的TMP、PLGA和BCA，精密稱量，溶于3 mL丙酮的有機(jī)相中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 % PVA(pH為5)的水溶液40 mL，作為水相.有機(jī)相緩慢加入水相中，常溫800 r·min-1磁力攪拌2 h，0.1 mol·L-1NaOH調(diào)pH為7，除凈有機(jī)溶劑，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得TMP-BCA-PLGA納米粒.

2.2 TMP-BCA-PLGA納米粒的包封率測定

2.2.1 紫外分光光度法

精密稱取5 mg TMP對照品于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的儲備液，從中吸取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成2.5、5、10、15、20 μg/mL一系列質(zhì)量濃度的對照液，在波長295 nm條件下測定吸光度，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示川芎嗪在2.5～20 μg范圍內(nèi)成呈良好的線性關(guān)系，得回歸方程為A=0.041 6C-0.008 5(r2=1).

2.2.2 TMP-BCA-PLGA納米粒的包封率測定

精密量取TMP-BCA-PLGA納米粒混懸液1 mL放置超濾離心管中，16 000 r·min-1離心30 min，精密量取外管液200 μL，于10 mL容量瓶中，用酸水稀釋至刻度，按2.2.1項下方法測定游離的TMP的含量；精密量取TMP-BCA-PLGA納米?；鞈乙?00 μL放置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳后稀釋至刻度，按2.2.1項下方法測定TMP-BCA-PLGA納米粒中TMP的總含量，計算納米粒中TMP的包封率.

2.3 TMP-BCA-PLGA納米粒的粒徑、Zata電位測定

取TMP-BCA-PLGA納米?；鞈乙海眉兓♂尯?，25 ℃放置激光粒徑測定儀中，測定其粒徑分布及Zeta電位值.

2.4 TMP-BCA-PLGA納米粒的處方篩選

2.4.1 水相pH的確定

配制pH 1～7的水溶液，其他組分的處方量不變，平行制備TMP-BCA-PLGA納米粒.按2.2.2項下測定包封率，按2.3項下測定粒徑.結(jié)果見表1.

表1 水相pH對納米粒粒徑和包封率的影響(n=3)

由表1可知，pH對納米粒粒徑和包封率影響較大，pH為6時粒徑最小，在pH 1～5范圍內(nèi)包封率隨pH的增加而增大，分析原因可能是TMP為生物堿，在pH低的溶液中由于酸性太大，藥物可能還沒被聚合物包裹就有一部分被酸溶解而成鹽，導(dǎo)致包封率降低.pH 6包封率較低，pH 7包封率小幅增加，綜合粒徑及包封率結(jié)果確定pH為5.

2.4.2 PVA型號及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

醫(yī)藥的PVA 有PVA05-88，PVA17-88，PVA-124等規(guī)格，考慮到PVA-124的聚合度較大，因此主要對PVA05-88，PVA17-88的型號進(jìn)行篩選.固定pH為5，分別配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PVA 的溶液為水相，保持處方中其他組分的量不變，平行制備TMP-BCA-PLGA納米粒.按2.2.2項測定包封率，按2.3項測定粒徑.結(jié)果見表2.

表2 PVA型號及質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米粒粒徑和包封率的影響

由表2可知，同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同型號的PVA，17-88的粒徑比05-88的大，但包封率比05-88的高很多，因此確定型號為17-88，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVA(17-88)溶液，隨PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，粒徑變化不是很大，包封率呈上升趨勢，但在PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，在液下注入時針孔附近聚集成球，分析原因可能是PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大，黏度增加，導(dǎo)致有機(jī)相進(jìn)入水相速度減慢，不易擴(kuò)散，從而聚集成球，綜合粒徑和包封率結(jié)果確定PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%.

2.4.3 PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

PVA(17-88)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，體系中pH為5，篩選PLGA(50/50, 相對分子質(zhì)量20 000)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%和3%，保持其他組分的處方量不變，平行制備三份TMP-BCA-PLGA納米粒混懸液.按2.2.2項測定包封率，按2.3項測定粒徑.結(jié)果見表3.

表3 PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米粒粒徑和包封率的影響(n=3)

由表3可知，PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米粒粒徑影響不大，隨PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，包封率增大.分析原因可能是隨著聚合物濃度升高，有機(jī)相的黏度增加，阻礙了TMP分散到納米液滴中，導(dǎo)致包封率降低粒徑變大，綜合表3結(jié)果確定PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%.

2.4.4 BCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

PVA(17-88)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，體系中pH為5，PLGA(50/50, 相對分子質(zhì)量20 000)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，保持其他組分的處方量不變，篩選不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的BCA丙酮溶液，平行制備三份TMP-BCA-PLGA納米?；鞈乙?按2.2.2項測定包封率，按2.3項測定粒徑.結(jié)果見表4.

表4 BCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米粒粒徑和包封率的影響

由表4可知，隨著BCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，粒徑也隨之增大，原因可能為質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加單位體積與水中OH-聚合加快，同時不易擴(kuò)散，附近的納米粒由于聚集而使粒徑增加所致，但包封率相差不大，綜合粒徑和包封率結(jié)果確定BCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%.

2.4.5 PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比

固定pH為5，PVA型號為17-88，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%的BCA丙酮液，保持處方中其他組分的量不變，平行制備TMP-BCA-PLGA納米粒.按2.2.2項測定包封率，按2.3項測定粒徑.結(jié)果見表5.

由表5可知，PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比對包封率影響不是很大，但隨著BCA加入體積的增加，粒徑變大，分析原因可能為BCA與水中OH-發(fā)生聚合，藥物被包封后，多余的BCA也發(fā)生聚合，進(jìn)一步包裹納米粒從而使粒徑增加，綜合考慮確定PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比為1∶1.

表5 PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比對納米粒粒徑和包封率的影響

2.4.6 有機(jī)相和水相體積比

固定pH為5，PVA(17-88)、PLGA、BCA丙酮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、0.75%，VPLGA∶VBCA比例為1∶1，保持處方中其他組分的量不變，平行制備TMP-BCA-PLGA納米粒.按2.2.2項測定包封率，按2.3項測定粒徑.結(jié)果見表6.

表6 有機(jī)相和水相體積比對納米粒粒徑和包封率的影響

由表6可知，有機(jī)相和水相比例對納米粒粒徑影響不大，但隨著有機(jī)相和水相比例的增加，包封率逐漸增大，分析原因可能是水相比例增加，在注射器液下注入時，相同體積的有機(jī)相與水相接觸面積增大，載體與水相發(fā)生聚合幾率增大，同時水相液面高度適宜，這樣有機(jī)相可以很好的擴(kuò)散到水相以減小有機(jī)相進(jìn)入水相，由于空間不足造成粒徑變大的影響.而降低兩相比例能顯著增加納米粒包封率，減少突釋.綜合以上因素確定有機(jī)相和水相的比例為1∶40.

2.5 處方的確定

根據(jù)2.4處方篩選結(jié)果表明最優(yōu)處方：有機(jī)相和水相體積比為1∶40，PVA(17-88)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，體系中pH為5，PLGA(50/50, 相對分子質(zhì)量20 000)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，BCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%，PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比為1∶1.

2.6 優(yōu)化處方納米粒的表征

2.6.1 TMP-BCA-PLGA納米粒的包封率

按照2.2.2 項下測定按照優(yōu)化處方制備的3 批納米粒的包封率，結(jié)果見表7.

表7 不同批次川芎嗪納米粒包封率

2.6.2 TMP-BCA-PLGA納米粒的粒徑、Zata電位

取TMP-BCA-PLGA納米粒，用純化水稀釋，25 ℃下用激光粒徑測定儀，測定其粒徑分布及Zeta電位值，見圖1.TMP-BCA-PLGA納米粒平均粒徑為234.9 nm.

圖1 川芎嗪納米粒粒徑圖

3 討 論

1)近年來，傳統(tǒng)的藥物劑型已不能滿足人們的需求[6].本文采用改良的乳化溶劑揮發(fā)法和界面縮聚法制備TMP-BCA-PLGA納米粒，PLGA作為藥物載體材料優(yōu)勢為生物可降解相容性，而BCA也具有此性質(zhì)、同時還具備釋藥持續(xù)性、低毒的特點，作載體能顯著提高藥物的生物利用度，并有良好的控制釋放、靶向投遞等功能.若單用BCA，由于BCA是在酸性條件下發(fā)生聚合，TMP為生物堿會造成其在酸性水相中溶解成鹽而使藥物的包封率降低，和PLGA合用主要考慮到其水相使用PVA溶液，黏度較大，可以減慢藥物進(jìn)入水相的速度，從而使TMP被PLGA包裹，之后再用BCA進(jìn)行聚合，可以避免藥物被酸性環(huán)境溶解，單用PLGA可能達(dá)不到藥物靶向的作用，這樣二者合用不僅可以減少藥物在酸性水相中溶解同時可以發(fā)揮PBCA在靶向投遞方面的作用.

2)川芎嗪為生物堿，pH對其影響因素較大，同時使用BCA及PLGA載體，BCA載體對pH也有一定的要求，主要與水中的OH-發(fā)生聚合進(jìn)而包裹藥物，若水相的pH過低，H+含量高，BCA的聚合太慢，會導(dǎo)致川芎嗪還沒被包裹就被過高的酸性環(huán)境所溶解成鹽，同時還不易形成納米粒，pH過高，OH-濃度大，反應(yīng)聚合太快，納米粒容易聚集成球，PLGA在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中容易降解，因此綜合以上因素確定pH為5，既符合酸性條件BCA可以聚合，反應(yīng)不至于太劇烈，又不會使PLGA在強(qiáng)酸性環(huán)境下而降解.

3)本文主要對處方進(jìn)行篩選，但對PLGA的型號沒有篩選，因有研究報道PLGA 50/50在體內(nèi)降解較快，包封率較高[15].對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及轉(zhuǎn)速以及PLGA與BCA加入時間進(jìn)行考慮，后期會進(jìn)一步研究.