趙閩家，楊娜娜，吳 迪，王 旭，孫文斌，徐蓓蕾*

(1.哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，哈爾濱150025；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱150076)

《證治匯補(bǔ)》里初次記載黃芪-葛根藥對(duì)配伍，即黃芪葛根湯.此方需稱取黃芪一兩，野葛五錢，以水煎服，適用于氣虛體弱，飲酒過多，體內(nèi)虛熱，脈搏微弱等癥狀，患者服后會(huì)有出汗的現(xiàn)象，逐漸好轉(zhuǎn)[1-2].《醫(yī)略六書》也曾記載黃芪-葛根配伍使用，以黃芪補(bǔ)人氣血，提升陽氣，用葛根增強(qiáng)機(jī)體免疫力，相輔相成，能發(fā)揮出極大藥效[3].此外，黃芪與葛根的毒性副作用極低，安全性高，極受歡迎.

葛根主要活性成分是異黃酮類化合物和少量黃酮類物質(zhì)，研究表明葛根中異黃酮類成分含量較高.異黃酮可分為苷類和甙類兩類，前者包括葛根素、大豆苷等，后者主要指大豆苷、染料木素、香豆素和異甘草酸苷等.葛根素是目前中藥葛根中被研究最多的活性成分，研究表明其對(duì)腦微循環(huán)系統(tǒng)具有良好的增益作用[4-6].現(xiàn)代臨床表明葛根可降低血壓、減緩心率、降低心肌耗氧量、并能有效減少血糖血脂，葛根中的活性成分具有較好的緩解心律失常的作用，且對(duì)自由基及其他相關(guān)物質(zhì)具有良好的清除效果.黃芪的主要化學(xué)活性成分為黃芪多糖、皂苷和黃酮類化合物等，此外黃芪中還含有20余種氨基酸和多種微量元素，其中黃酮類的活性物質(zhì)多達(dá)30余種[7-9].黃芪的活性成分對(duì)免疫系統(tǒng)有著極為顯著的調(diào)節(jié)作用[10].實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪不僅可以改善非正常心血管的功能，對(duì)正常機(jī)體也可起到良好的保護(hù)作用，此外，黃芪還具有調(diào)節(jié)改善神經(jīng)中樞，增益肝臟，調(diào)節(jié)、抑制腫瘤惡化，緩解病癥等作用[11-12].

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高速多功能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市恒久儀器制造有限公司)，98-1-B調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)，ISO9001分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

葛根，購于同仁堂藥店，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)曲中原教授鑒定為豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd)Ohwi)的干燥根.黃芪，購于同仁堂藥店，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)曲中原教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的干燥根.

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品鑒定研究所，批號(hào)：20170118)，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 乙醇加熱回流法提取工藝研究

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

稱取10 g葛根-黃芪粉末(古方配比1∶1)，在料液比為1∶10，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為2 h的條件下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%對(duì)總黃酮提取量的影響.結(jié)果顯示當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%時(shí)，總黃酮提取量最高，見圖1.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

稱取10 g葛根-黃芪粉末，使用65%的乙醇溶劑，在料液比為1∶10，提取溫度為60 ℃條件下，考察提取時(shí)間在1、1.5、2、2.5、3 h條件下總黃酮提取量的情況.隨著提取時(shí)間的延長，含總黃酮量逐漸升高，說明時(shí)間越久越利于總黃酮的溶出，2.5 h后總黃酮的提取量無明顯增加，故選擇適宜提取時(shí)間為2.5 h，見圖2.

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

取葛根-黃芪粉末10 g，使用65%的乙醇溶劑進(jìn)行提取，置于45、55、65、75、85 ℃水浴鍋中持續(xù)加熱2 h，考察提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響.結(jié)果表明總黃酮提取量隨著提取溫度的升高而逐漸上升，但由于乙醇沸點(diǎn)為78.31 ℃，且當(dāng)溫度過高時(shí)乙醇溶劑極易揮發(fā)，因此選適宜提取溫度為75 ℃，見圖3.

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

2.2 水煎煮法提取工藝研究

2.2.1 煎煮時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

取葛根-黃芪粉末10 g，加水浸泡30 min，料液比1∶20，水煎煮時(shí)間分別為30、60、90、120 min，提取次數(shù)2次，考察煎煮時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響.隨著水煎煮時(shí)間的增加，含總黃酮量也在增加，但是超過60 min后增加不大，且隨著時(shí)間延長，提取產(chǎn)生的雜質(zhì)增多，因此選擇水煎煮時(shí)間為60 min，如圖4.

圖4 煎煮時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

2.2.2 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響

取葛根-黃芪粉末10 g，用水浸泡30 min，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，水煎煮時(shí)間60 min，提取次數(shù)2次，考察液料比對(duì)總黃酮提取量的影響，隨著料液比的增加，含總黃酮量也在增加，當(dāng)料液比1∶20時(shí)，得到的含總黃酮量趨于頂點(diǎn)，綜合試劑成本及總黃酮提取量，故選擇料液比1∶20，如圖5.

圖5 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

取葛根-黃芪粉末10 g，用水浸泡30 min，在料液比為1∶20，水煎煮時(shí)間60 min條件下，考察不同提取次數(shù)，即分別提取1次、2次、3次對(duì)總黃酮提取量的影響.實(shí)驗(yàn)中先將提取液用4層紗布過濾，得到粗濾液后再用濾紙過濾，合并濾液.結(jié)果表明當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)得到含總黃酮量趨于頂點(diǎn)，第三次提取沒有使含總黃酮量明顯增加，并且增加成本，因此選擇提取次數(shù)為2次，如圖6.

2.3 葛根-黃芪總黃酮的測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對(duì)照品5.00 mg，置50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容.配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液.精密移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL比色管中，用60%的乙醇稀釋至5 mL，將5mL60%的乙醇作為空白對(duì)照組，并分別向其中加入5%的亞硝酸鈉0.3 mL，充分搖勻，靜置6 min.再加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，充分搖勻，靜置6 min，再分別加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，用60%乙醇定容至刻度.搖勻，靜置12 min后，在510 nm下測定.以蘆丁對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=5.94X+0.022 4，R2=0.998 2.說明總黃酮質(zhì)量濃度在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系.

2.3.2 精密度考察

精密移取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL于比色管中，加60%乙醇稀釋至5 mL后，同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，于510 nm 波長下測定吸光度值，重復(fù)測定6次，RSD為0.22%，表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好.

2.3.3 重復(fù)性考察

用移液管移取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL于比色管中，加60%乙醇稀釋至5 mL后，同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，于510 nm波長下測定吸光度值，重復(fù)測定6次，RSD為0.89%，表明重復(fù)性良好.

2.3.4 穩(wěn)定性考察

選取蘆丁對(duì)照品溶液，于0、2、4、6、8、10 h測定吸光度值，RSD為0.41%(n=6)，表明在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

吸取上述樣品溶液10 mL加入上述制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL(共6份)，黃酮平均加樣回收率為96.92 %，測定結(jié)果在95%～105%范圍內(nèi)，RSD為4.44 %(n=18)，其值小于5%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)回收率良好.

2.3.6 葛根-黃芪總黃酮供試品的測定

準(zhǔn)確稱量0.050 0 g 樣品置燒杯中，加入95%的乙醇10 mL溶解，完全溶解后將其置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻并靜置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻并靜置6 min，再加4%NaOH溶液10 mL，95%的乙醇定容，搖勻并靜置15 min，以水為參比溶液，用分光光度法在510 nm的波長處測定吸光度(A).由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出，醇提含總黃酮類化合物量為2.74 mg/g，水提含總黃酮類化合物量為0.06 mg/g.

3 討 論

水煎煮法是常見的傳統(tǒng)提取方法，提取工藝簡單，但其缺點(diǎn)較多，耗時(shí)長，雜質(zhì)多，且易腐敗變質(zhì)，使后續(xù)的分離純化難度增大[13-14].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水煎煮法提取總黃酮得率遠(yuǎn)低于乙醇回流提取法總黃酮提取量，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水煎煮法的提取液極難過濾，因?yàn)楦鸶S芪中含有多糖成分，在提取中也會(huì)被一同提取出來，致使提取液雜質(zhì)過多，黏性較大.綜合考慮，不建議采用水煎煮提取方法.而乙醇加熱回流法作為中藥傳統(tǒng)提取方法中最常用的提取方法，其提取工藝簡單，成本較低，提取時(shí)間適當(dāng)，雜質(zhì)較少，易于分離，提取量相對(duì)較高，對(duì)比水煎煮提取法具有很大優(yōu)勢.

葛根黃芪藥對(duì)的配伍從古至今得到了廣泛的應(yīng)用，研究表明總黃酮是葛根-黃芪提取物的主要有效成分[15].本實(shí)驗(yàn)通過單因素考察法對(duì)總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化并采用紫外分光光度法測定葛根-黃芪藥對(duì)提取物中含總黃酮量，進(jìn)行方法學(xué)考察，得到良好的線性關(guān)系和方法回收率，可為葛根-黃芪藥對(duì)的擴(kuò)展應(yīng)用提供依據(jù).