王晶晶 楊華 倪建宏 盧守亮 支建忠 石國(guó)慶 劉長(zhǎng)彬 萬(wàn)鵬程

摘要：研究同期發(fā)情處理中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）的外周血生殖激素含量變化與發(fā)情時(shí)間的關(guān)系，探討中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）最佳人工輸精時(shí)間。分別采集經(jīng)孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理母羊在埋栓前1 d、埋栓后 7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）和撤栓/PMSG肌注48 h的外周血，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)外周血中雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、孕酮（P）的質(zhì)量濃度，分析試驗(yàn)?zāi)秆蛟谕诎l(fā)情處理前后外周血中生殖激素含量變化，統(tǒng)計(jì)分析生殖激素質(zhì)量濃度的相關(guān)性和4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異顯著性。研究結(jié)果，對(duì)孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗(yàn)?zāi)秆蛲庵苎臣に氐腅LISA檢測(cè)，與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗(yàn)羊外周血中E2、FSH、LH含量顯著升高（P<0.05），P含量顯著下降（P<0.05），且不同個(gè)體間不同激素含量的波動(dòng)范圍明顯減小，達(dá)到相對(duì)一致水平，與該時(shí)間點(diǎn)的中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）集中發(fā)情現(xiàn)象相吻合。結(jié)果表明，孕酮陰道海綿栓+PMSG處理后的48 h是中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）集中發(fā)情的高峰時(shí)間，也是最佳輸精時(shí)間。

關(guān)鍵詞：中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）;同期發(fā)情;生殖激素;ELISA;E2;FSH;LH;P

中圖分類號(hào)：S826.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0187-05

綿羊同期發(fā)情是人為控制母羊群體同一時(shí)間發(fā)情和配種，具有便于統(tǒng)一飼草料配給、提高勞動(dòng)生產(chǎn)效率和提高綿羊生殖效率的優(yōu)點(diǎn)。生殖激素直接調(diào)控母羊發(fā)情、排卵等生殖過(guò)程，影響同期發(fā)情和人工授精的效果。綿羊?qū)儆诩竟?jié)性發(fā)情動(dòng)物，一般是在短日照的秋季開(kāi)始發(fā)情[1]，其季節(jié)性發(fā)情受到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控[2]，與綿羊的生殖激素有密切聯(lián)系。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)綿羊生殖激素季節(jié)性變化進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道。Suttie等研究發(fā)現(xiàn)，短日照可以促進(jìn)綿羊孕酮（P）分泌，而長(zhǎng)日照則明顯地抑制P的分泌[3];Smith等發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物一般在發(fā)情前會(huì)出現(xiàn)一次雌二醇（E2）峰[4];Chemineau等研究發(fā)現(xiàn)，繁殖季節(jié)綿山羊血液中促黃體素（LH）和促卵泡素（FSH）濃度高于非繁殖季節(jié)，存在季節(jié)性變化[5];賀建寧等研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性發(fā)情的灘羊的P、E2、LH、FSH濃度在春季、夏季、秋季、冬季4個(gè)季節(jié)變化明顯[6]。中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）是我國(guó)培育的優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊品種，是典型的季節(jié)性發(fā)情哺乳動(dòng)物，且每年產(chǎn)羔1次，每胎多為1羔。為探討綿羊外周血生殖激素含量變化與發(fā)情時(shí)間的關(guān)系，篩選最佳人工輸精時(shí)間。本研究分析繁殖季節(jié)中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）同期發(fā)情處理的不同階段外周血中E2、FSH、LH和P含量的變化情況，以期為提高同期發(fā)情和人工授精成功率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年9—11月，試驗(yàn)動(dòng)物均采自新疆紫泥泉種羊場(chǎng)，中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）母羊共計(jì)480只，平均年齡3歲，平均體質(zhì)量（38.4±1.4） kg，體格健壯，膘情較好，無(wú)生殖道疾病和乳房疾病。生殖、營(yíng)養(yǎng)、健康等方面狀況良好且個(gè)體之間無(wú)明顯差異。試驗(yàn)處理前2周對(duì)綿羊做好防疫和驅(qū)蟲工作，并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。從中選取20只健康的全舍飼中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）母羊，應(yīng)用孕酮海綿 栓+330 IU PMSG（孕馬血清促性腺激素）進(jìn)行同期發(fā)情處理，埋栓處理 13 d 后撤栓，撤栓時(shí)肌注PMSG 330 IU。自撤栓后24～72 h，每隔12 h進(jìn)行1次公羊試情，記錄母羊發(fā)情時(shí)間和發(fā)情數(shù)量，計(jì)算撤栓后72 h內(nèi)母羊的發(fā)情率。血樣采集：在埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h，PMSG肌注前）、撤栓/PMSG肌注48 h，分別頸靜脈采血 5 mL/只，1 000 g×10 min離心分離血清。

1.2 試驗(yàn)藥品與主要儀器

1.2.1 主要試劑

孕酮陰道海綿栓，含35 mg氟孕酮，寧波市三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn);PMSG，1 000 IU/瓶，寧波市三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn);綿羊ELISA檢測(cè)試劑盒FSH（RY-12131）、LH（RY-12111）、P（RY-12074）和E2（RY-12134）均購(gòu)于上海潤(rùn)裕生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器

酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，Muhiskanmk3 Inc）美國(guó)生產(chǎn)。

1.3 生殖激素的測(cè)定

采用ELISA法測(cè)定血清中E2、FSH、LH和P的含量。按試劑盒的操作步驟測(cè)定D450 nm值，并以D450 nm值為橫坐標(biāo)，含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程。FSH的回歸方程為y=67.352x2+14.563x+2.060，r2=0.994 3;LH的回歸方程為y=103.440 0x2+4.297 8x+1.358 9，r2=0991 8;E2的回歸方程為y=112.900 0x2+25.900 0x+2191 1，r2=0.988 1;P的回歸方程為y=1 773.200x2+3 667.900x-30.839，r2=0.998 7。根據(jù)回歸方程計(jì)算出E2、FSH、LH和P的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

E2、FSH、LH和P的含量以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，使用SPSS 21.0對(duì)不同階段外周血中E2、FSH、LH和P的含量進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，處理0～72 h母羊的發(fā)情率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕酮海綿栓+PMSG同期發(fā)情處理前后的中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）生殖激素含量比較

2.1.1 E2含量 試驗(yàn)羊外周血E2分泌水平在埋栓前1 d最低，為（28.35±8.58） ng/L，埋栓后7 d有較大幅度升高，為（52.95±8.41） ng/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出現(xiàn)回落，含量為（29.95±11.42） ng/L，撤栓/PMSG肌注48 h后升至最高點(diǎn)，為（60.18±5.87） ng/L（表1）。其中撤栓/PMSG肌注48 h后E2分泌水平與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差異顯著（P<0.05）（圖1）。

2.1.2 FSH含量 試驗(yàn)羊外周血FSH分泌水平在埋栓前1 d最低，為（21.23±5.54） IU/L，埋栓后 7 d 有所升高，為（25.01±5.00） IU/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出現(xiàn)回落，為（23.57±5.06） IU/L，撤栓/PMSG肌注48 h后升至最高點(diǎn)，為（40.30±307） IU/L（表1）。其中撤栓/PMSG肌注48 h后FSH分泌水平與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差異顯著（P<0.05）（圖1）。

2.1.3 LH含量 試驗(yàn)羊外周血LH分泌水平在埋栓前1 d最低，為（18.59±9.25） ng/L，埋栓后7 d有所升高，為（21.01±9.93） ng/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出現(xiàn)回落，為（19.54±6.16） ng/L，撤栓/PMSG肌注48 h后LH分泌水平升至最高點(diǎn)，為（29.37±4.55） ng/L（表1），但與埋栓前1 d、埋栓后7 d和埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差異均不顯著（P>0.05）（圖1）。

2.1.4 P含量 試驗(yàn)羊外周血P分泌水平在埋栓前1 d最低，為（2 047.38±949.02） pmol/L，埋栓后7 d達(dá)到最高，為（3 300.66±861.46） pmol/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）分泌水平下降，為（2 443.59±592.32） pmol/L，撤栓/PMSG肌注48 h后繼續(xù)降低至（2 182.49±354.31） pmol/L（表1）。其中埋栓后7 d試驗(yàn)羊P分泌水平與埋栓前1 d、埋栓后 13 d、撤栓/PMSG肌注48 h相比均差異顯著（P<0.05）（圖1）。

從圖2可以看出，在埋栓前1 d、埋栓后7 d和埋栓后13 d（撤栓0 h）激素分泌水平個(gè)體差異較大，撤栓/PMSG肌注48 h后則達(dá)到相對(duì)均一水平，均值標(biāo)準(zhǔn)差均以埋栓前1 d為最大，撤栓/PMSG肌注48 h最小，說(shuō)明在經(jīng)過(guò)孕酮海綿栓+PMSG處理后，試驗(yàn)羊的生殖激素分泌基本達(dá)到同步狀態(tài)。

2.2 同期發(fā)情處理的綿羊LH含量與FSH、E2、P含量之間的相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，孕酮海綿栓+PMSG同期發(fā)情處理后，中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）中外周血中E2、FSH、LH、P含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）（表2），其中LH含量與FSH、E2、P含量之間呈中度正相關(guān)關(guān)系，F(xiàn)SH含量與E2、P含量呈中度正相關(guān)關(guān)系，E2含量與P含量之間呈低度正相關(guān)。

2.3 同期發(fā)情處理母羊的發(fā)情率

記錄孕酮海綿栓處理的母羊在撤栓后72 h發(fā)情率，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）同期發(fā)情處理的總發(fā)情率是87.5%，撤栓后>24～48 h同期化程度最高，發(fā)情率為70.0%，顯著高于0～24 h的7.5%和>48～72 h的10.0%（表3）。

3 討論與結(jié)論

同期發(fā)情技術(shù)在綿羊繁殖過(guò)程中被廣泛應(yīng)用，但影響同期發(fā)情的因素很多，導(dǎo)致綿羊發(fā)情率存在較大的差別。海綿栓是目前綿羊同期發(fā)情中最常用的埋植栓劑，孕酮海綿栓+PMSG肌注法的同期發(fā)情處理效果要優(yōu)于孕酮海綿栓+PG法，孕酮海綿栓與PMSG聯(lián)合使用的效果優(yōu)于單一使用孕酮海綿栓[7]。

Scaramuzzi等檢測(cè)結(jié)果表明，發(fā)情期綿羊的卵巢靜脈和外周靜脈血血漿E2和LH濃度在排卵時(shí)顯著升高[8]。張壽等發(fā)現(xiàn)，青海半細(xì)毛羊的E2濃度水平在發(fā)情當(dāng)日最高，而P濃度水平在發(fā)情的前1 d、發(fā)情的當(dāng)天和發(fā)情后2 d均較低，發(fā)情當(dāng)天的含量最低，發(fā)情后10 d濃度上升[9]。趙松華等研究發(fā)現(xiàn)，非繁殖季節(jié)中國(guó)美利奴羊血清中E2含量顯著上升[10]。本研究中對(duì)孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗(yàn)?zāi)秆蛲庵苎臣に氐腅LISA檢測(cè)，與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗(yàn)羊外周血中E2含量顯著升高（P<0.05），且激素含量的波動(dòng)范圍明顯減小，達(dá)到相對(duì)一致水平，與該時(shí)間點(diǎn)的集中發(fā)情現(xiàn)象相吻合，表明撤栓48 h前后是中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）發(fā)情、排卵高峰，本試驗(yàn)結(jié)果與孫五洋的結(jié)論[11]一致。

Karsch等研究表明，LH峰值出現(xiàn)前48～60 h，黃體開(kāi)始急劇退化，導(dǎo)致血中P4濃度急劇下降，此時(shí)外周血中E2和LH濃度開(kāi)始緩慢升高，促使垂體釋放大量LH而引起排卵[12]。Martineza lvarez等應(yīng)用不同處理方法誘導(dǎo)母羊發(fā)情時(shí)，LH峰出現(xiàn)和排卵時(shí)間無(wú)關(guān)[13]。張英杰等研究發(fā)現(xiàn)，全年的高繁殖力小尾寒羊血漿FSH和LH濃度均極顯著高于低繁殖力和季節(jié)性發(fā)情的細(xì)毛羊[14];LH濃度水平通常在發(fā)情期呈現(xiàn)最高峰，F(xiàn)SH有相同的高峰趨勢(shì)，但不如LH明顯[15]。本研究中對(duì)孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗(yàn)?zāi)秆蛲庵苎臣に氐腅LISA檢測(cè)，與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓 0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗(yàn)羊外周血中FSH和LH含量顯著升高（P<0.05），且激素含量的波動(dòng)范圍明顯減小，達(dá)到相對(duì)一致水平，與該時(shí)間點(diǎn)的集中發(fā)情現(xiàn)象相吻合，說(shuō)明撤栓48 h前后是中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）發(fā)情、排卵高峰。張振漢等測(cè)得雙羔組發(fā)情日血清E2含量是單羔組的15倍，雙羔組母羊在發(fā)情日血清LH含量出現(xiàn)峰值后迅速下降，到發(fā)情后10 d恢復(fù)到發(fā)情前1 d的水平，單羔組母羊血清LH峰值出現(xiàn)在發(fā)情后1 d[16]。不同動(dòng)物垂體中FSH/LH的比率及其含量也相同，這與動(dòng)物的發(fā)情時(shí)間、排卵時(shí)間及發(fā)情表現(xiàn)有關(guān)[17]。

P的主要作用是“啟動(dòng)”母羊的發(fā)情，促使卵巢從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S狀態(tài)，從而使母羊正常發(fā)情和排卵[18]。Carlson等報(bào)道，由于與黃體分泌P相疊加，在母羊血漿中P濃度高于植栓后3 d[19]。Theodosiadou等研究結(jié)果表明，高劑量P進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)情處理時(shí)，會(huì)擾亂羊本身體內(nèi)激素濃度，導(dǎo)致了較低的妊娠率[20]。Karagiannidis等報(bào)道，MPA陰道栓植入陰道后1 d，奶中的P濃度水平上升，然后降到一個(gè)穩(wěn)定的水平直到在撤栓后24 h，P水平降到基礎(chǔ)水平[21]。Campbell等報(bào)道，植栓的0～1 d P4濃度水平上升，2～3 d P水平下降，9～10 d至撤栓，P維持基礎(chǔ)濃度水平[22]。Lazar等報(bào)道，血清中P濃度在撤栓后3 h下降[23]。張海容等證明，在乏情期外周血中P濃度保持較低的水平，在15 d有1個(gè)波動(dòng)周期，在發(fā)情后24 h E2濃度上升，P濃度下降[24]。侯衍猛等證明，在發(fā)情期和間情期血漿內(nèi)的FSH和LH濃度均呈脈沖式分泌，E2和P為波動(dòng)式分泌，P在間情期一直維持較高濃度水平[25]。謝炳坤等研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物在發(fā)情前后有1個(gè)較低的P濃度水平，其變化有利于母畜進(jìn)入下一個(gè)發(fā)情周期[26]。王金富等對(duì)中國(guó)美利奴軍墾型細(xì)毛羊發(fā)情周期血清中P濃度進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，發(fā)情后 1 d P含量顯著高于0 d[27]。

本研究對(duì)孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗(yàn)?zāi)秆蛲庵苎臣に氐腅LISA檢測(cè)，與埋栓前 1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗(yàn)羊外周血中P含量顯著下降，且激素含量的波動(dòng)范圍明顯減小，達(dá)到相對(duì)一致水平，與該時(shí)間點(diǎn)的集中發(fā)情現(xiàn)象相吻合，說(shuō)明撤栓48 h前后是中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）發(fā)情、排卵高峰，P含量在撤栓48 h顯著下降，與E2、FSH、LH濃度變化不同，這可能與中國(guó)美利奴羊（新疆軍墾型）發(fā)情配種后妊娠有關(guān)。

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收稿日期：2019-07-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2017YFD0501904）;國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：CARS-40-07）;省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：SKLSGIHP2016A01、SKLSGIHP2017A02）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃（編號(hào)：2016AC027）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重大科技項(xiàng)目（編號(hào)：2017AA006）。

作者簡(jiǎn)介：王晶晶（1995—），女，河南沈丘人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：2318525314@qq.com。

通信作者：萬(wàn)鵬程，博士，研究員，主要從事綿羊繁育與家畜胚胎生物技術(shù)研究，E-mail：pengcheng.wan@gmail.com;劉長(zhǎng)彬，博士，研究員，主要從事綿羊繁育與家畜胚胎生物技術(shù)研究，E-mail：xlchangbin@163.com。