于紅艷，張昕欣，婁 歡，王蘇玲

(1.臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)與制藥工程學(xué)院，浙江 臺州 318000；2.臺州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，浙江 臺州 318000)

對羥基苯甲酸是重要的有機(jī)合成原料，也是對羥基甲苯、聯(lián)苯、多環(huán)芳烴等多種芳香化合物生物代謝的中間產(chǎn)物[1]，廣泛應(yīng)用于化工、塑料、食品、醫(yī)藥及染料工業(yè)中[2]。近年來不斷有研究指出，對羥基苯甲酸具有雌激素活性[3]，它們通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境[4]，對水體、土壤和大氣造成污染，并逐漸威脅到人類健康[5]。由于對羥基苯甲酸具有很強(qiáng)的抑菌作用，所以對對羥基苯甲酸污染的修復(fù)特別是生物修復(fù)具有較大的難度[6-7]。對羥基苯甲酸降解菌株的好氧降解途徑主要包括:鄰位途徑[8]、間位途徑[8]、龍膽酸途徑[9]和原兒茶酸途徑。目前已知的菌株對對羥基苯甲酸的降解速率及降解效率不甚理想[10-11]，菌株在降解對羥基苯甲酸時的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)量變化也未見相關(guān)的研究報道。

作者采用平板劃線法從臺州市某印染廢水中篩選高效對羥基苯甲酸降解菌株，對其形態(tài)及生理生化特性進(jìn)行分析，用cDNA文庫構(gòu)建的方法對其純培養(yǎng)和對羥基苯甲酸脅迫的基因進(jìn)行比較分析，查找降解對羥基苯甲酸的調(diào)控基因并推測降解途徑，以期為對羥基苯甲酸污染的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗

1.1 試劑與培養(yǎng)基

對羥基苯甲酸，購于上海麥克林生化科技有限公司，用丙酮配成1.0 g·L-1的母液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾除菌，備用；其它試劑均為分析純。

葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基：硫酸銨0.2%，檸檬酸鈉0.1%，七水合硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，蛋白胨0.1%，葡萄糖0.2%，pH值7.2。

對羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基：硫酸銨0.2%，檸檬酸鈉0.1%，七水合硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，蛋白胨0.1%，pH值7.2；滅菌后加入對羥基苯甲酸丙酮母液，使終濃度為200 mg·L-1。

1.2 菌株的篩選與分離

取適量某印染廢水作為菌源水體，置于葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中25 ℃搖床培養(yǎng)3 d；取富集培養(yǎng)液1 mL接種于對羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基中，于25 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d；將培養(yǎng)物稀釋涂布于固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)至有肉眼可見的明顯菌落長出；在固體無機(jī)鹽平板上連續(xù)劃線轉(zhuǎn)板3次，挑取菌落大、生長較快的單菌株接入對羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基斜面，4 ℃保存，備用。

1.3 菌株的鑒定

參照Barnett法[12]對篩選出的菌株的形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定，參照Ebada法[13]對篩選出的菌株的生理生化特性進(jìn)行鑒定。

1.4 菌株的cDNA文庫構(gòu)建和基因測序

將篩選出的菌株在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至OD600=1；離心，收集菌體，分別重懸于等體積的對羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基與葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)72 h；離心，收集菌體，采用TRIzol法(Invitrogen，美國)提取總RNA[14]。以5 μg總RNA起始量建庫，采用TruSeq RNA文庫制備試劑盒(Illumina)構(gòu)建文庫，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)；cBot上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，生成clusters；在Hiseq 2500測序平臺進(jìn)行2×100 bp測序[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)與生理生化特性

經(jīng)過分離純化，得到一株能以對羥基苯甲酸為唯一碳源(200 mg·L-1)生長的菌株。該菌株的菌落特征為：圓形，白色，表面光滑，邊緣齊整；生理生化特性為：細(xì)胞呈卵圓形，革蘭氏染色陽性，有芽孢，出芽生殖。

菌株經(jīng)過PCR擴(kuò)增、測序，選擇同源性大于97%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株與克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)的同源性最高，結(jié)合菌株形態(tài)、菌落特征及生理生化特性，鑒定為克雷白氏桿菌，命名為K.pneumoniaeTzyx1。

2.2 K.pneumoniae Tzyx1降解對羥基苯甲酸的調(diào)控基因及降解途徑

根據(jù)K.pneumoniaeTzyx1 unigenes功能注釋分析結(jié)果[16]，推測K.pneumoniaeTzyx1對對羥基苯甲酸的降解途徑如圖1所示，涉及對羥基苯甲酸原兒茶酸代謝途徑的調(diào)控基因有8個，列于表1。

圖1 K.pneumoniae Tzyx1對對羥基苯甲酸的降解途徑

表1 K.pneumoniae Tzyx1中涉及對羥基苯甲酸原兒茶酸代謝途徑的調(diào)控基因

根據(jù)注釋結(jié)果，K.pneumoniaeTzyx1至少存在1種完整的KEGG pathway記錄的苯環(huán)開環(huán)方式，是在單加氧酶(p-hydroxybenzoate 3-monooxygenase)的作用下在對羥基苯甲酸的3位引入一個羥基將其轉(zhuǎn)化生成原兒茶酸，原兒茶酸擁有鄰二醇結(jié)構(gòu)，可以被雙加氧酶開環(huán)。之后，在原兒茶酸3,4-雙加氧酶(protocate-chuate 3,4-dioxygenase)的作用下內(nèi)開環(huán)生成3-羧基粘康酸。這些開環(huán)產(chǎn)物在一系列水解酶、水合酶和醛縮酶的作用下，經(jīng)過反應(yīng)代謝為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，進(jìn)入檸檬酸循環(huán)(圖1)。

2.3 K.pneumoniae Tzyx1降解對羥基苯甲酸的其它基因(表2)

表2 K.pneumoniae Tzyx1降解對羥基苯甲酸的其它基因

表2列出了K.pneumoniaeTzyx1中可能參與苯環(huán)開環(huán)后的降解、但不參與上述代謝途徑的其它基因。如脫羧酶(4-carboxymuconolactone decarboxylase)，其催化對羥基苯甲酸的脫羧反應(yīng)生成苯酚[17]，苯酚在苯酚單加氧酶的催化下轉(zhuǎn)化成鄰苯二酚；又如CoA連接酶，其可以催化對羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成4-羥基苯甲酰-CoA。由此推斷K.pneumoniaeTzyx1可能存在其它未報道的參與苯環(huán)開環(huán)的基因，也有可能存在其它未報道的苯環(huán)開環(huán)方式。

3 結(jié)論

K.pneumoniaeTzyx1涉及對羥基苯甲酸原兒茶酸代謝途徑的調(diào)控基因有8個，存在至少一種完整的KEGG pathway記錄的苯環(huán)開環(huán)方式，原兒茶酸代謝途徑的起始化合物為有取代基團(tuán)的芳烴類化合物。同時，K.pneumoniaeTzyx1可以降解無取代基團(tuán)的芳烴類化合物，且存在一些參與其它苯環(huán)開環(huán)降解途徑的下游基因。因此，K.pneumoniaeTzyx1可能存在其它芳烴化合物的降解途徑，如脫碳酸途徑和苯甲酰-CoA還原途徑。