韓 璐，黃薏霏，那襲雪，張文濤，宋 丹，楊 宏，寧小清，*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西南寧市婦幼保健院，廣西 南寧 530000)

壯藥白花九里明來源于菊科艾納香屬植物東風(fēng)草(Blumeamegacephala(Randeria)Chang et Tseng)的地上部分[1]。研究表明，白花九里明藥材含有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸[2]以及有機酸、黃酮類化合物等止血成分[3]；白花九里明提取物對小鼠子宮平滑肌具有明顯收縮作用[4]。為了進一步弄清白花九里明提取物中的有效成分及其含量，作者采用高效液相色譜法和酶標(biāo)法對提取物中的原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、總黃酮[5-6]、總有機酸[7]的含量進行測定。

1 實驗

1.1 藥材、試劑與儀器

白花九里明藥材，采自南寧市郊，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院寧小清高級實驗師鑒定為菊科艾納香屬植物東風(fēng)草(Blumeamegacephala(Randeria)Chang et Tseng)的地上部分。

原兒茶酸對照品、綠原酸對照品、咖啡酸對照品，中國食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸，色譜純；甲醇、乙醇，分析純；超純水。

e2695型高效液相色譜儀，美國Waters；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國Millipore；P300H型中型超聲波清洗機，德國Elma Schmidbauer GmbH；Infinite M200PRO型光吸收微孔板檢測儀，奧地利Tecan Austrla GmbH。

1.2 白花九里明提取物的制備

取干燥的白花九里明藥材1.5 kg，加水超聲提取，過濾；濾液濃縮后加入乙醇使醇含量為70%～85%，靜置，過濾，濾液干燥后即得白花九里明提取物146.25 g。

1.3 色譜條件

Inert Sustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙睛-0.1%磷酸(8∶92，體積比，下同)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。檢測波長250 nm和327 nm：0～10 min，327 nm；10～20 min，250 nm；20～45 min，327 nm。典型圖譜見圖1。

圖1 對照品(a)和白花九里明提取物(b)的HPLC圖譜

1.4 對照溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸對照品適量，配成3種有機酸質(zhì)量濃度分別為0.174 mg·mL-1、0.200 mg·mL-1、0.071 mg·mL-1的混合對照溶液，供HPLC分析使用；精密稱取槲皮素對照品適量，配成0.082 4 mg·mL-1槲皮素對照溶液，供酶標(biāo)分析使用；精密稱取原兒茶酸對照品適量，配成0.216 mg·mL-1原兒茶酸對照溶液，供酶標(biāo)分析使用。

1.5 供試溶液的制備

精密稱取白花九里明提取物約0.5 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，超聲10 min后于3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液，供HPLC分析使用。

精密稱取白花九里明提取物70 mg，置于100 mL容量瓶中，加入1%三氯化鋁溶液4 mL，用70%甲醇定容，供酶標(biāo)法測總黃酮使用。

精密稱取白花九里明提取物70 mg，置于100 mL容量瓶中，加入50%甲醇60 mL、0.3%SDS溶液20 mL、1%鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液10 mL，用0.1 mol·L-1HCl溶液定容，供酶標(biāo)法測總有機酸使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸的含量測定

2.1.1 線性關(guān)系

取混合對照溶液，分別進樣2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL,按色譜條件測定, 記錄峰面積。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、進樣量(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程：原兒茶酸：y=3247876.3x-161259.7(R2=0.9999)，線性范圍0.348～3.132 μg；綠原酸：y=2366620.2x-153803.1(R2=0.9999)，線性范圍0.4～3.6 μg；咖啡酸：y=2138932.2x-76685.8(R2=0.9999)，線性范圍0.142～1.278 μg。

2.1.2 精密度

精密吸取混合對照溶液10 μL, 按色譜條件連續(xù)進樣6次。計算原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.39%、0.40%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

精密吸取供試溶液，按色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定。計算原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD分別為1.72%、0.78%、1.82%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.4 重復(fù)性

精密稱取同一供試品6份, 按1.5方法制備供試溶液, 按色譜條件進樣測定。計算原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD(n=6)分別為1.77%、0.98%、1.60%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率

按1.5方法平行制備6份供試溶液，每份精密加入原兒茶酸對照品、綠原酸對照品、咖啡酸對照品0.696 mg、1.000 mg、0.210 mg，制成樣品溶液。分別進樣測定，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

從表1可知，原兒茶酸平均加標(biāo)回收率為98.07%，RSD為1.35%；綠原酸平均加標(biāo)回收率為97.49%，RSD為1.42%；咖啡酸平均加標(biāo)回收率為99.81%，RSD為0.43%。

表1 3種有機酸的加標(biāo)回收率(n=6)

2.1.6 含量測定

根據(jù)方法學(xué)考察, 原兒茶酸在0.348～3.132 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；綠原酸在0.4～3.6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；咖啡酸在0.142～1.278 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加標(biāo)回收率的RSD值均符合含量測定要求。測得白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的含量分別為1.29 mg·g-1、3.68 mg·g-1、0.81 mg·g-1。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 線性關(guān)系

精密量取槲皮素對照溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加入4 mL 1%的三氯化鋁溶液，用70%甲醇定容，吸取100 μL，測定溶液在373 nm處吸光度。以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、槲皮素濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得槲皮素線性回歸方程為：y=10.933x-0.0151(R2=0.9998)，線性范圍8.24～41.20 μg·mL-1。

2.2.2 精密度

精密量取槲皮素對照溶液100 μL，連續(xù)檢測6次。計算RSD(n=6)為0.171%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性

精密稱取同一供試品6份，按1.5方法制備供試溶液，取100 μL檢測。計算RSD(n=6)為0.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性

精密量取供試溶液100 μL，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測。計算RSD為2.14%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.5 加標(biāo)回收率

精密稱取供試品35 mg，按1.5方法平行制備6份供試溶液，精密加入0.78 mg槲皮素對照品，制成樣品溶液。精密量取各樣品溶液100 μL檢測，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 槲皮素的加標(biāo)回收率(n=6)

從表2可知，槲皮素的平均加標(biāo)回收率為102.4%，RSD為0.75%。

2.2.6 含量測定

根據(jù)方法學(xué)考察, 槲皮素在8.24～41.20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。測得白花九里明提取物中總黃酮含量為22.33 mg·g-1。

2.3 總有機酸的含量測定

2.3.1 線性關(guān)系

精密量取原兒茶酸對照溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加入50%甲醇6 mL、0.3%SDS溶液2 mL、1%鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液1 mL，暗處靜置5 min，用0.1 mol·L-1HCl溶液定容，再暗處靜置20 min，吸取50 μL測定溶液在292 nm處吸光度。以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、原兒茶酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得原兒茶酸線性回歸方程為：y=8.5188x+2.1548(R2=0.9999)，線性范圍10.8～54.0 μg·mL-1。

2.3.2 精密度

精密量取原兒茶酸對照溶液50 μL，連續(xù)檢測6次。計算RSD(n=6)為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性

精密稱取同一供試品6份，按1.5方法制備供試溶液，精密吸取50 μL檢測。計算RSD為1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性

精密量取供試溶液50 μL，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測。計算RSD為1.32%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.5 加標(biāo)回收率

精密稱取供試品35 mg，按1.5方法平行制備6份供試溶液，精密加入6.657 mg原兒茶酸對照品，制成樣品溶液。精密量取各樣品溶液50 μL檢測，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 原兒茶酸的加標(biāo)回收率(n=6)

從表3可知，原兒茶酸的平均加標(biāo)回收率為101.1%，RSD為1.07%。

2.3.6 含量測定

根據(jù)方法學(xué)考察,原兒茶酸在10.8～54.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，測得白花九里明提取物中總有機酸含量為190.92 mg·g-1。

2.4 討論

采用HPLC法測定白花九里明提取物中的原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸的含量。對甲醇-0.1%磷酸(20∶80)、甲醇-水(20∶80)、乙腈-水(8∶92)和乙腈-0.1%磷酸(8∶92)等4種流動相進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸(8∶92)為流動相時，白花九里明提取物的色譜峰分離度較好，無拖尾現(xiàn)象。

酶標(biāo)法具有樣品和試劑用量少、速度快、效率較紫外可見分光光度法高等特點。因此，采用酶標(biāo)法測定白花九里明提取物中總黃酮和總有機酸的含量，其中，總黃酮含量測定采用三氯化鋁顯色法，總有機酸含量測定采用鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法。結(jié)果表明，三氯化鋁顯色法和鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法適用于白花九里明提取物中總黃酮和總有機酸的含量測定,具有簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點。

3 結(jié)論

建立了白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、總黃酮和總有機酸含量的測定方法。采用雙波長切換高效液相色譜法測定原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸的含量，原兒茶酸在0.348～3.132 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為98.07%，RSD為1.35%；綠原酸在0.4～3.6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為97.49%，RSD 為 1.42%；咖啡酸在0.142～1.278 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為99.81%，RSD為0.43%。白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的含量分別為1.29 mg·g-1、3.68 mg·g-1、0.81 mg·g-1。采用酶標(biāo)法測定總黃酮和總有機酸的含量，發(fā)現(xiàn)槲皮素在8.24～41.20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9998)，平均加標(biāo)回收率為102.4%，RSD為0.75%；原兒茶酸在10.8～54.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為101.1%，RSD為1.07%。白花九里明提取物中總黃酮和總有機酸含量分別為22.33 mg·g-1和190.92 mg·g-1。該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、總黃酮和總有機酸的含量測定方法。