張光輝，張 拴，靳如意，孟慶華

(陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 西安 712046)

甘草在我國主要分布在內蒙、甘肅、新疆等地[1]，具有益氣補脾、止咳祛痰、調和諸藥等功用[2-4]。甘草含有三萜皂苷類和黃酮類[5-7]等活性成分，其中黃酮類包括甘草素、甘草苷、異甘草苷、異甘草素等[8-10]。研究發(fā)現，甘草黃酮不但對金黃色葡萄球菌[11]、鏈球菌[12]等細菌具有抑制作用，還具有解痙、保肝[13]、抗衰老、防治心血管疾病等功效[14]，可作為防治心腦血管疾病的天然藥物和膳食補充劑[15]。目前，市場上甘草質量參差不齊，而甘草黃酮含量及抗氧化活性是衡量甘草質量的標準之一。因此，作者采用響應面法對甘草黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，并對不同產地甘草黃酮的含量及體外抗氧化活性進行比較，以期為甘草原產地鑒別及質量評價提供依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

內蒙古甘草，北京康美制藥有限公司；甘肅甘草、新疆甘草，陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司。

蘆丁標準品；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇等均為分析純；DPPH自由基，分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1102型紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；HJ-3A型數顯恒溫磁力攪拌器，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；HX502T型電子天平，慈溪天東衡器廠。

1.2 溶液的配制

稱取亞硝酸鈉2.50 g，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成質量濃度為5%的亞硝酸鈉溶液；稱取硝酸鋁5.00 g，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成質量濃度為10%的硝酸鋁溶液；稱取氫氧化鈉2.00 g，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成質量濃度為4%的氫氧化鈉溶液。

精密稱取蘆丁標準品0.005 0 g，用95%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，即得0.10 mg·mL-1的蘆丁標準溶液，室溫遮光保存，備用。

1.3 蘆丁標準曲線的繪制

精密吸取蘆丁標準溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中；滴加0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置3 min；再滴加0.30 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min后充分反應；最后滴加2.00 mL 4%氫氧化鈉溶液[16]，搖勻，用95%乙醇定容至10 mL，靜置10 min；用紫外可見分光光度計測定507 nm處吸光度[17]。以蘆丁濃度(mg·mL-1)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 甘草黃酮的提取

準確稱取甘草0.50 g，按一定液料比(mL∶g，下同)加入95%乙醇，在一定溫度下提取一定時間，即得甘草黃酮提取液，將提取液定容至50 mL，備用。

1.5 提取工藝優(yōu)化

以提取溫度(A)、提取時間(B)、液料比(C)為自變量，以甘草黃酮提取率為考核指標，設計3因素3水平響應面實驗，對甘草黃酮提取工藝進行優(yōu)化。響應面實驗的因素與水平見表1。

表1 響應面實驗的因素與水平

1.6 甘草黃酮含量測定

取5.0 mL甘草黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按1.3方法測定507 nm處吸光度(A)，按式(1)計算甘草黃酮含量(mg·g-1)：

(1)

1.7 體外抗氧化活性研究

精密稱取避光冷藏的DPPH自由基粉末0.005 0 g，加入無水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，得到0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液，避光保存，備用。

取甘草黃酮提取液，配制成0.005 4 mg·mL-1的甘草黃酮標準溶液；取2.00 mL標準溶液，滴加2.00 mL 0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液，避光放置30 min后測定吸光度(A測)；以2.00 mL 95%乙醇滴加2.00 mL 0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液為參比(A參)。按式(2)計算DPPH自由基清除率(%)[18]。

(2)

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線(圖1)

圖1 蘆丁標準曲線

對標準曲線進行擬合，得線性回歸方程：y=9.2771x+0.0026，R2=0.9956>0.99。表明，蘆丁溶液濃度在0.00～0.05 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 最優(yōu)提取工藝

采用響應面法優(yōu)化甘草黃酮提取工藝，結果見表2，方差分析見表3。

表2 響應面實驗結果

表3 方差分析

對表2數據進行擬合，得到多元二次回歸模型：Y=1.68-0.21A+0.084B+0.13C-0.20AB+0.13AC+0.025BC-0.14A2-0.072B2-0.035C2。

從表3可知，失擬項P=0.1193>0.05，說明沒有失擬因素；根據F值可知，3個因素對甘草黃酮提取率的影響大小依次為：液料比>提取時間>提取溫度。

提取溫度、提取時間、液料比交互作用對甘草黃酮提取率影響的響應曲面圖如圖2所示。

從圖2可知，響應面法優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝為：提取溫度86.7 ℃、提取時間4.0 h、液料比為80.0∶1.0。

圖2 各因素交互作用對甘草黃酮提取率影響的響應曲面圖

2.3 最優(yōu)提取工藝方法學考察

2.3.1 精密度

稱取甘草0.50 g，在最優(yōu)工藝條件下提取，提取液定容至50 mL容量瓶中。取2.00 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3方法連續(xù)測定5次吸光度，分別為0.342、0.345、0.341、0.342、0.339。計算RSD為0.22%(n=5)，表明該提取工藝精密度良好。

2.3.2 重復性

稱取5份甘草各0.50 g，在最優(yōu)工藝條件下提取，提取液定容至50 mL容量瓶中。分別取2.00 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3方法測定吸光度，分別為0.342、0.346、0.338、0.340、0.344。計算RSD為0.32%(n=5)，表明該提取工藝重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性

稱取甘草0.50 g，在最優(yōu)工藝條件下提取，提取液定容至50 mL容量瓶中。每隔20 min取2.00 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3方法測定吸光度，分別為0.347、0.342、0.339、0.338、0.335。計算RSD為0.46%(n=5)，表明該提取工藝穩(wěn)定性較好。

2.4 不同產地甘草黃酮含量對比

在最優(yōu)工藝條件下，采用醇提法提取內蒙古、新疆、甘肅等地甘草中的黃酮。取5.0 mL不同產地甘草黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按1.3方法測定507 nm處吸光度，計算甘草黃酮含量，結果見表4。

表4 不同產地甘草黃酮含量對比

從表4可知，在最優(yōu)工藝條件下，采用醇提法提取不同產地甘草中的黃酮，其中甘肅甘草黃酮含量最高，平均值達到18.22 mg·g-1，其次為新疆甘草黃酮，內蒙古甘草黃酮的含量最低。

2.5 體外抗氧化活性研究方法學考察

2.5.1 精密度

取2.00 mL甘肅甘草黃酮提取液，滴加2.00 mL DPPH自由基溶液，避光反應30 min[19]，以2.00 mL乙醇與2.00 mL DPPH自由基混合溶液為對照，以乙醇校零于517 nm[20]處連續(xù)測定5次吸光度。計算DPPH自由基清除率分別為63.81%、63.81%、63.97%、63.75%、63.97%，RSD為0.10%(n=5)，表明體外抗氧化活性研究方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性

取2.00 mL甘肅甘草黃酮提取液，滴加2.00 mL DPPH自由基溶液，避光反應30 min，以2.00 mL乙醇與2.00 mL DPPH自由基混合溶液為對照，分別于0 min、5 min、10 min、15 min、20 min以乙醇校零于517 nm處測定吸光度。計算DPPH自由基清除率分別為63.81%、63.81%、64.03%、63.33%、63.49%，RSD為0.28%(n=5)，表明DPPH自由基清除率在20 min內穩(wěn)定，體外抗氧化活性研究方法穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性

取5份甘肅甘草黃酮提取液，每份2.00 mL，分別滴加2.00 mL DPPH自由基溶液，避光反應30 min，以2.00 mL乙醇與2.00 mL DPPH自由基混合溶液為對照，以乙醇校零于517 nm處測定吸光度。計算DPPH自由基清除率分別為63.97%、63.49%、63.81%、63.87%、63.97%，RSD為0.63%(n=5)，表明體外抗氧化活性研究方法重復性良好。

2.6 不同產地甘草黃酮的體外抗氧化活性對比

分別取2.00 mL 0.005 4 mg·mL-1的不同產地甘草黃酮標準溶液，滴加2.00 mL 0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液，避光反應30 min后測定517 nm處吸光度，計算DPPH自由基清除率，結果見表5。

表5 不同產地甘草黃酮的體外抗氧化活性對比

從表5可知，相同濃度下，內蒙古甘草黃酮的體外抗氧化活性最差，甘肅和新疆的甘草黃酮的體外抗氧化活性相近。

3 結論

采用響應面法對甘草黃酮的醇提法提取工藝進行優(yōu)化，最優(yōu)提取工藝條件為：提取溫度86.7 ℃、提取時間4.0 h、液料比80.0∶1.0(mL∶g)。3個產地甘草黃酮含量大小依次為：甘肅>新疆>內蒙古，分別為18.22 mg·g-1、17.75 mg·g-1、16.82 mg·g-1。3個產地甘草黃酮的體外抗氧化活性大小依次為：甘肅>新疆>內蒙古，對DPPH自由基的清除率分別為63.82%、62.74%、51.41%。此結論可作為甘草原產地鑒別及質量評價的參考依據之一，為甘草藥材的開發(fā)利用提供幫助。