陳鵬 孫玉良 鄧星

[摘要] 目的 評估高靈敏度實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）在病毒性肝病病毒核酸定量檢測中的臨床應用價值，為該方法的普及應用提供依據(jù)。 方法 收集2016年1月～2018年12月于湖北省中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的病毒性肝病患者895例，同期選取我院100名健康體檢者作為對照組。分別應用常規(guī)方法和高靈敏度real-time PCR方法檢測血清病毒核酸載量，比較兩種方法檢測結果的差異。對其中低病毒載量患者的生物化學指標、免疫學指標、凝血國際標準化比值（INR）和肝纖維化FIB-4指數(shù)的變化趨勢、特點及其與病毒核酸載量的相關性進行統(tǒng)計分析。 結果 受檢人群中低病毒載量患者呈高比例分布。高靈敏度real-time PCR方法檢測HBV DNA的陽性率遠高于常規(guī)方法（P < 0.05），而對于HCV RNA，兩種方法檢測結果的一致性較好。低病毒載量患者的多項生物化學指標波動并不明顯，且多項生物化學指標與病毒核酸載量無相關性（P > 0.05）。大部分低病毒載量乙肝患者表現(xiàn)為HBeAg陰性的低水平復制狀態(tài)。免疫學診斷指標與病毒核酸載量間存在不同程度的不一致和弱關聯(lián)度。低病毒載量患者的凝血INR和肝纖維化FIB-4指數(shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但其與病毒核酸載量無相關性（P > 0.05）。 結論 高靈敏度real-time PCR方法對病毒核酸載量的檢測具有不可比擬的優(yōu)勢，結合其他的診斷指標，其可在低拷貝病毒性肝病的病程管理中發(fā)揮不可替代的重要作用。

[關鍵詞] 高靈敏度;實時熒光定量聚合酶鏈反應;病毒性肝病;病毒核酸定量;低病毒載量

[中圖分類號] R446 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0151-05

[Abstract] Objective To evaluate the clinical application value of high-sensitivity real-time polymerase chain reaction （real-time PCR） in the quantitative detection of viral nucleic acid in viral hepatitis， and to provide the basis for the widespread application of this method. Methods A total of 895 patients with viral hepatitis were enrolled from January 2016 to December 2018 in Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine （hereinafter referred to as “our hospital”）， and meanwhile another 100 normal people in our hospital were recruited as control group. Serum viral loads were detected by routine and high sensitive real-time PCR， then the difference of results between the two methods was compared. The trends and characteristics of biochemical indices，immunological markers， international standardized ratio of coagulation （INR）， index of liver fibrosis FIB-4 and their correlation with viral load were analyzed statistically in viral hepatitis patients with low viral load. Results The proportion of patients with low viral load was high among the population surveyed. The positive rate of HBV DNA detected by real-time PCR with high sensitivity was much higher than that by routine method（P < 0.05），but for HCV RNA， the two methods showed good consistency. The fluctuation of several biochemical indices was not obvious in low viral load patients， and multiple biochemical indexes were not correlated with viral nucleic acid load （P > 0.05）. Most hepatitis B patients with low viral load showed a status of low level HBeAg-negative replication. There were different degrees of inconsistency and weak correlation between immunological diagnostic markers and viral load results. INR of coagulation and FIB-4 index of liver fibrosis in patients with low viral load were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）， but there was no correlation between them and viral nucleic acid load （P > 0.05）. Conclusion High sensitivity real-time PCR has incomparable advantages in the detection of viral nucleic acid，combined with other diagnostic markers，it can play an irreplaceable role in the course management of low viral load hepatitis.

[Key words] High sensitivity; Real-time polymerase chain reaction; Viral hepatitis; Viral nucleic acid quantification; Low viral load

由乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）引起的病毒性肝炎及其并發(fā)癥是世界性的公共衛(wèi)生問題，根據(jù)精準化的檢測結果進行規(guī)范化的抗病毒治療可有效地改善患者的生活質量[1-2]。病毒核酸的載量是臨床確診病毒性肝病的重要依據(jù)，也是反映病毒活動狀態(tài)最直接、最可靠的觀察指標，在病毒性肝病的診斷和治療等多個方面均具有重要的參考價值，由此，應用高效的檢測方法對病毒核酸進行精準定量便成為了規(guī)范化診療的關鍵所在[3-4]。當前，基于基因擴增技術的實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）已成為病毒核酸定量檢測的“金標準”，但囿于技術上的落后和方法學上的差異，相對于國外產品，國產試劑盒的檢測性能還有較大差距，尤其對于低載量病毒的動態(tài)監(jiān)測仍存在不同程度的盲區(qū)，極大地限制了病毒性肝病患者的診斷和治療[5-6]。為此，本研究僅選取低病毒載量的病例，了解其流行病學特征并分析不同診斷指標的變化及與病毒核酸的相關性，以評估高靈敏度real-time PCR在病毒性肝病診斷和治療中的臨床應用價值，為高靈敏度技術在精準醫(yī)療中的普及應用提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月～2018年12月在湖北省中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）門診或住院治療的895例患者作為研究對象，其中男551例，女344例;年齡18～84歲，平均（47.78±14.10）歲。同期選取我院100例健康體檢者作為對照組，其中男62例，女38例，年齡20～76歲，平均（45.14±14.64）歲。納入標準：年齡≥18周歲;就診前未接受抗病毒治療或停止治療3年以上;臨床診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》[7]和《丙型肝炎防治指南（2015更新版）》[8]中的診斷標準。排除標準：①合并其他肝炎病毒或嗜肝病毒感染;②脂肪肝、代謝性肝病、自身免疫性肝炎、酒精性肝病及其他原因（藥物、寄生蟲）引起的肝功能異常;③罹患其他器官嚴重疾病;④使用影響凝血功能的藥物;⑤因感染、免疫性、腫瘤或治療等原因所致的血小板（PLT）降低。低病毒載量患者與健康體檢者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

①Sysmex XN9000血細胞分析儀及配套質控品和試劑;②Sysmex CA7000凝血分析儀，質控品和試劑購自上海太陽生物公司;③Beckman-CoIUlter AIU5800生化分析儀，校準品和試劑全部由寧波美康生物科技有限公司提供，質控品購自美國Bio-Rad公司;④ARCHITECT i2000SR化學發(fā)光微粒子免疫檢測系統(tǒng)及質控品和試劑由美國雅培公司提供;⑤Mx3000P型熒光定量PCR儀購自Agilent Technologies公司，常規(guī)病毒核酸定量采用國產real-time PCR試劑盒，高靈敏度病毒核酸real-time PCR檢測儀及試劑盒均來自于某國際標準化檢測系統(tǒng)。

1.3 觀察指標

①PLT計數(shù)：采集患者外周血進行血液學常規(guī)檢驗。②國際標準化比值（INR）測定：檢測血漿凝血酶原時間（PT）并計算INR。③肝功能指標檢測：檢測患者血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、總膽紅素（TBIL）、結合膽紅素（DBIL）、總膽汁酸（TBA）、膽固醇酯（CHE）和總固醇（CHO）水平。④免疫學檢驗：定量檢測血清甲胎蛋白（AFP）、乙肝五項和丙肝抗體。⑤病毒核酸定量：平行測定。常規(guī)檢測采用煮沸高速離心法（HBV）和柱洗脫法（HCV）提取核酸，加入Taq酶進行核酸擴增，檢測線性范圍為1.0×102～5.0×108 IU/mL（HBV）和1.0×103～1.0×107 IU/mL（HCV）;高靈敏度檢測使用磁珠捕獲法提取核酸，加入尿苷酶（AmpErase）和脫氧尿苷三磷酸（dIUTP），應用ZO5（和）ZO5D DNA聚合酶進行選擇性擴增，檢測線性范圍為2.0×10～1.7×108 IU/mL（HBV）和1.5×10～1.0×108 IU/mL（HCV）。以HBV DNA<100 IU/mL或HCV RNA<1000 IU/mL歸類為低病毒載量患者。⑥基于4因子的肝纖維化指數(shù)（FIB-4）指數(shù)：FIB-4=（年齡×AST）/（PLT×ALT的平方根）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗用非參數(shù)Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗，非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，兩組資料間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U秩和檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關方法。計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。檢測結果的對比分析采用關聯(lián)度分析及一致性檢驗（Kappa）和優(yōu)勢性檢驗（McNemar）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病毒性肝病患者血清病毒核酸載量檢測結果分布

全部受檢樣本共檢出HBV DNA陽性333例（占63.92%），HCV RNA陽性43例（占11.50%）。479例乙肝患者中檢出HBV DNA載量低于500 IU/mL 367例（占76.62%），低于100 IU/mL 319例（占66.60%）;245例丙肝患者中檢出HCV RNA載量低于1000 IU/mL 219例（占89.39%）。見表1。

常規(guī)方法和高靈敏度real-time PCR方法HBV DNA檢測結果比較，一致性較差（Kappa = 0.039，rp = 0.141，P < 0.05），高靈敏度real-time PCR方法的陽性率（48.43%）遠高于常規(guī)方法（33.40%）;對于HCV RNA，兩種方法檢測結果的一致性較好（Kappa = 0.709，rp = 0.579，P > 0.05）。

2.2 低病毒載量患者與健康人群生物化學指標的比較

除HBV組的ALB和GLO外，低病毒載量患者的多項生物化學指標與對照組比較，均有不同程度的變化（P < 0.05），但其波動幅度并不明顯。此外，秩相關分析的結果也顯示除HBV DNA與ALT有低相關性（P < 0.05），低病毒載量患者的多項生物化學指標與病毒核酸載量無相關性（P > 0.05）。見表2～3。

2.3 免疫學指標

895例研究對象中同時檢測乙肝免疫學標志物和病毒核酸載量共377例，其中受檢的355例乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性樣本中有110例未檢出病毒核酸，同時，22例HBsAg陰性患者有6例HBV DNA陽性。256例低病毒載量乙肝患者的免疫學指標多表現(xiàn)為乙型肝炎e抗原（HBeAg）陰性的低水平復制狀態(tài)[214例（83.59%）]，其次為HBeAg陽性模式，兩類模式（1-3-5和1-4-5）的分布比例明顯高于其他模式，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=110.3，P < 0.05）。見表4。相關性分析顯示低病毒載量乙肝患者的HBV DNA與HBsAg、HBeAg濃度均具有相關性（P < 0.05），但關聯(lián)度較弱（HBsAg：rs=0.277;HBeAg：rs=0.189）。此外，低病毒載量患者中AFP的陽性率較低（HBV：9.95%;HCV：15.74%），其與病毒核酸載量無相關性（HBV DNA：rs = 0.060;HCV RNA：rs = -0.069，P > 0.05）。

2.4 其他診斷指標

低病毒載量患者的凝血INR和FIB-4指數(shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但其與病毒核酸載量無相關性（INR：HBV：rs = 0.013;HCV：rs = 0.035，P > 0.05;FIB-4：HBV：rs = 0.030;HCV：rs = 0.046，P > 0.05）。見表5。

3 討論

感染性疾病的診療應按照循證醫(yī)學的原則來進行。目前，病毒核酸的載量仍是評估病毒性肝病進展的核心指標，準確的病毒核酸檢測結果也是病程管理的重要依據(jù)[9-10]。由此，規(guī)范化的精準診療目標和病毒性肝病管理與治療的現(xiàn)行指南均明確指出，對病毒核酸的定量必須使用靈敏度高且線性范圍廣的檢測方法[11-15]。熒光定量PCR是目前臨床實驗室病毒核酸載量檢測常用的方法，而高靈敏度real-time PCR則在方法學上做了進一步的優(yōu)化，大大提高了核酸檢測的性能，尤其對于低拷貝病毒的精準定量，具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢。

高靈敏度PCR檢驗技術是病毒感染性疾病重要的診斷方法。值得注意的是臨床上低病毒載量患者的高比例分布，尤其是處于常規(guī)方法檢測限以下的病例。由于這部分患者病毒的拷貝數(shù)并不在常規(guī)檢測的線性范圍內，不精準的定量結果將導致誤診和漏診的可能。而對比分析的結果顯示高靈敏度real-time PCR能提供更低的拷貝量和更高的檢出率，幾乎做到了對低載量病毒的“全覆蓋”，這對于病毒感染性疾病的精準診療具有重要的意義。此外，對于丙肝病毒核酸，兩種方法定量檢測的關聯(lián)度較好，究其原因可能與病毒載量的兩極化分布有關。

核酸載量的變化對于病毒活動狀態(tài)的評估具有不可替代的作用。本研究的數(shù)據(jù)分析顯示肝炎病毒的活動對肝功能有顯著影響，但肝功能的變化并不能單獨作為低病毒載量患者病毒活動評估的直接依據(jù)。生物化學指標的變化是整個有機體生物學功能的外在表現(xiàn)，受到多種外在因素的影響，具有代償性、非特異性的特點。此外，已有研究[16-18]表明肝炎病毒在患者體內的分布存在不均一性，其區(qū)域化的差異也會導致血清生物化學指標與病毒核酸載量變化的不一致，本研究中多名生物化學指標異常而血清病毒核酸載量為零的病例也驗證了這一現(xiàn)象的存在。

病毒核酸的載量是病毒感染性疾病臨床診斷、療效觀察最直接、最可靠的依據(jù)。由于窗口期的存在、抗原表位的變化、抗原來源的多樣性、檢測方法的局限性等原因，免疫學標志物與病毒核酸載量的變化并不完全同步[19-21]。本研究的統(tǒng)計結果充分顯示相較于病毒核酸，免疫學標志物并不能及時、有效地反映病毒的存在及其復制情況，單獨依據(jù)免疫學標志物來評估低拷貝病毒性肝病患者的病情仍存在缺陷[22]。與此同時，由于病毒核酸的持續(xù)復制是導致病情反復和進展的主要原因，多篇文獻[21，23-24]報道和相關診療指南也皆強調以病毒核酸載量及其變化作為病毒應答評判和臨床治療決策的指征，這些結論也進一步證實了高靈敏度分子診斷方法在病毒性肝病治療監(jiān)測中的重要作用。

由于潛在的肝損傷和繼發(fā)并發(fā)癥的高風險，應用高靈敏度的核酸檢測方法對低病毒載量病毒性肝病患者進行常規(guī)檢測是十分有必要的[25]。有研究顯示[26]，F(xiàn)IB-4和INR在高病毒載量感染或肝功能嚴重受損失代償時能很好地預測肝臟的病理風險和生理功能，但在低病毒載量患者或肝損傷早期，其并不能替代病毒核酸載量有效地評估肝損害，本研究中FIB-4和INR指數(shù)的分析結果與此一致。

綜上所述，高靈敏度real-time PCR是病毒核酸載量重要的檢測方法，結合其他的診斷指標，其能夠為低病毒載量患者提供更加精準的定量結果，在病毒性肝病的病程管理中具有較高的臨床實用價值。

[參考文獻]

[1] ?Sun YT，Zhang YX，Tang H，et al. Clinical characteristics and current management of hepatitis B and C in China [J]. World J Gastroenterol，2014，20（37）：13582-13590.

[2] ?Qin Q，Smith MK，Wang L，et al. Hepatitis C virus infection in China：an emerging public health issue [J]. J Viral Hepat，2015，22（3）：238-244.

[3] ?Strassl R，Rutter K，St？覿ttermayer AF，et al. Real-time PCR assays for the quantification of HCV RNA：concordance，discrepancies and implications for response guided therapy [J]. PLoS One，2015，10（8）：e0135963.

[4] ?周惠娟，謝青.精準醫(yī)學時代中國丙型肝炎診療一體化的病毒學應答指導治療策略[J].臨床肝膽病雜志，2016， 32（7）：1262-1265.

[5] ?Cai SH，Lv FF，Zhang YH，et al. Dynamic comparison between Daan real-time PCR and Cobas TaqMan for quantification of HBV DNA levels in patients with CHB [J]. BMC Infect Dis，2014，14：85.

[6] ?Villar LM，Cruz HM，Barbosa JR，et al. Update on hepatitis B and C virus diagnosis [J]. World J Virol，2015，4（4）：323-342.

[7] ?中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）[J].中華肝臟病雜志，2015，23（12）：888-905.

[8] ?中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.丙型肝炎防治指南（2015更新版）[J].中華肝臟病雜志，2015， 23（12）：906-923.

[9] ?Singh MP，Galhotra S，Saigal K，et al. Quantitative nucleic acid amplification methods and their implications in clinical virology [J]. Int J Appl Basic Med Res，2017，7（1）：3-9.

[10] ?陳合民，邵國輝.核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎停藥標準的探討[J].臨床肝膽病雜志，2016，32（7）：1283-1286.

[11] ?European Association for Study of Liver. EASL Clinical Practice Guidelines：management of hepatitis C virus infection [J]. J Hepatol，2014，60（2）：392-420.

[12] ?European Association for Study of Liver. EASL Recommendations on treatment of hepatitis C 2015 [J]. J Hepatol，2015，63（1）：199-236.

[13] ?Terrault NA，Bzowej NH，Chang KM，et al. AASLD guidelines for treatment of chronic hepatitis B [J]. J Hepatol，2016，63（1），261-283.

[14] ?European Association for the Study of the Liver. EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection [J]. J Hepatol，2017，67（2），370-398.

[15] ?World Gastroenterology Organisation. World Gastroenterology Organisation global guidelines：diagnosis，management，and prevention of hepatitis C（2017 update）[EB/OL]. World Gastroenterology Organisation，2017.

[16] ?劉立，劉春云，王霖，等.低水平HBsAg患者肝組織HBsAg、HBcAg表達與血清HBsAg水平、HBV DNA載量的相關性[J].實用醫(yī)學雜志，2017，33（21）：3639-3642.

[17] ?Tripodi G，Larsson SB，Norkrans G，et al. Smaller reduction of hepatitis B virus DNA in liver tissue than in serum in patients losing HBeAg [J]. J Med Virol，2017， 89（11）：1937-1943.

[18] ?Wang H，F(xiàn)ang M，Gu X，et al. The intracellular HBV DNAs as novel and sensitive biomarkers for the clinical diagnosis of occult HBV infection in HBeAg negative hepatocellular carcinoma in China [J]. PLoS One，2014，9（9）：e107162.

[19] ?Arora S，Doda V，Kirtania T. Sensitivity of individual donor nucleic acid testing（NAT） for the detection of hepatitis B infection by studying diluted NAT yield samples [J]. Blood Transfus，2015，13（2）：227-232.

[20] ?Khadem-Ansari MH，Omrani MD，Rasmi Y，et al. Diagnostic validity of the chemiluminescent method compared to polymerase chain reaction for hepatitis B virus detection in the routine clinical diagnostic laboratory [J]. Adv Biomed Res，2014，3：116.

[21] ?Laperche S，Nübling CM，Stramer SL，et al. Sensitivity of hepatitis C virus core antigen and antibody combination assays in a global panel of window period samples [J]. Transfusion，2015，55（10）：2489-2498.

[22] ?Liu C，Chang L，Ji H，et al. Prevalence of HBV DNA among 20 million seronegative blood donations in China from 2010 to 2015 [J]. Sci Rep，2016，11（6）：1-7.

[23] ?Cheng J，Dai Y，Yan L，et al. Clinical characteristics and correlation analysis of subjects with chronic hepatitis B virus （HBV） infection and sustained low levels of hepatitis B surface antigen（HBsAg）[J]. Med Sci Monit，2018， 24：1826-1835.

[24] ?Jiang JN，Huang ZL，He LX，et al. Residual amount of HBV DNA in serum is related to relapse in chronic hepatitis B patients after cessation of nucleos（t）ide analogs [J]. J Clin Gastroenterol，2015，49（4）：323-328.

[25] ?Liu YP，Yao CY. Rapid and quantitative detection of hepatitis B virus [J]. World J Gastroenterol，2015，21（42）：11954-11963.

[26] ?康曉征，趙勇，蔣善珍，等.FIB-4指數(shù)聯(lián)合天冬氨酸氨基轉移酶與血小板比值對HBV患者治療后病情轉歸的預測價值[J].實用醫(yī)學雜志，2018，34（11）：1782-1786.

（收稿日期：2019-11-18）