于雪姣 張芳 周磊

[摘要] 目的 探討彈力纖維染色在判斷結(jié)直腸癌臟層腹膜彈力層侵犯和血管侵犯中的應用價值及臨床意義。方法 選取2013年1月～2016年12月山東省青島市市立醫(yī)院結(jié)直腸癌組織學標本75例，采用常規(guī)HE染色和地衣紅彈力纖維染色的方法觀察標本中的臟層腹膜侵犯、臟層腹膜彈力層侵犯和血管侵犯情況，并觀察與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、神經(jīng)侵犯及腫瘤出芽之間的關(guān)系。 結(jié)果 彈力纖維染色臟層腹膜彈力層腫瘤侵犯的檢出率高于HE染色的檢出率，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;臟層腹膜彈力層侵犯陽性患者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯及腫瘤出芽發(fā)生率高于臟層腹膜彈力層侵犯陰性的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;臟層腹膜彈力層侵犯陽性患者其神經(jīng)侵犯發(fā)生率高于臟層腹膜彈力層不存在的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;彈力纖維染色血管侵犯檢出率高于HE染色，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其特異性為100.0%，敏感性為65.8%。 結(jié)論 彈力纖維染色能夠明顯提高結(jié)直腸癌的臟層腹膜彈力層侵犯和血管侵犯檢出率，臟層腹膜彈力層侵犯陽性的患者提示腫瘤預后不良，臟層腹膜彈力層侵犯可能作為結(jié)直腸癌分期的臨床病理指標之一。

[關(guān)鍵詞] 癌;結(jié)直腸;臟層腹膜;彈力層侵犯;血管侵犯

[中圖分類號] R365 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0024-04

[Abstract] Objective To explore the application value and clinical significance of elastica staining in identifying visceral peritoneal elastic lamina invasion and vascular invasion of colorectal cancer. Methods From January 2013 to December 2016， 75 colorectal cancer histological specimens were selected from Qingdao Municipal Hospital， the peritoneal invasion of the visceral layer， the peritoneal invasion of the visceral layer and the vascular invasion in the specimens were observed by conventional HE staining and lichen red elastic fiber staining. The relationship among lymph node metastasis， vascular invasion， nerve invasion and tumor budding were observed. Correlations between visceral peritoneal elastic lamina invasion and lymph metastasis， vascular invasion， perineural invasion， tumor budding were also investigated. Results Elastic fiber staining results showed the positive rate of visceral peritoneal elastic lamina invasion was higher than that of HE staining， and the difference was statistically significant （P < 0.05）; the incidence of lymph metastasis， vascular invasion and tumor budding in visceral peritoneal elastic lamina invasion positive cases were higher than those in peritoneal elastic lamina invasion negative cases， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the incidence of nerve invasion in patients with positive visceral peritoneal elastic layer invasion was higher than that in patients without visceral peritoneal elastic layer invasion， and the difference was statistically significant （P < 0.05）; elastic fiber staining revealed that the detection rate of vascular invasion was higher than HE staining， and the difference was statistically significant （P < 0.05）， and with 100.00% specificity and the 65.8% sensitivity. Conclusion Elastic fiber staining can significantly improve the detection rate of visceral peritoneal elastic layer invasion and vascular invasion. Patients with positive visceral peritoneal elastic layer invasion suggest poor tumor prognosis， and visceral peritoneal elastic layer invasion may be one of the clinicopathological indicators for colorectal cancer staging.

[Key words] Cancer; Colorectum; Visceral peritoneal; Elastic lamina invasion; Vascular invasion

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類高發(fā)惡性腫瘤，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示我國結(jié)直腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中居第5位，死亡/發(fā)病比為50.8%[1]。臟層腹膜侵犯（visceral peritoneal invasion，VPI）是結(jié)直腸癌術(shù)后病理分期（pTNM）及臨床個體化治療的重要指標。在實際臨床病理工作中，VPI的判定主要依據(jù)HE染色的鏡下觀察，由于腫瘤組織破壞腹膜結(jié)構(gòu)，周圍膠原纖維增生及炎性反應易導致臟層腹膜侵犯的低診斷，因此能否找到客觀性判讀指標是結(jié)直腸癌病理分期中需要解決的重要問題。血管侵犯（vascular invasion，VI）是結(jié)直腸癌Ⅰ類預后因子[2-3]，是評估遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤預后和療效預測的重要指標[4-6]，HE染色鏡下觀察和免疫組化染色均可造成假陰性結(jié)果。本研究通過彈力纖維染色檢測結(jié)直腸癌組織中臟層腹膜彈力層侵犯（visceral peritoneal elastic lamina invasion，VPELI）和VI的發(fā)生率，并觀察與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VI、神經(jīng)侵犯、腫瘤出芽之間的關(guān)系，考察彈力纖維染色以及VPELI在結(jié)直腸癌臨床病理分期中的應用價值及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2016年12月山東省青島市市立醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術(shù)切除結(jié)直腸癌標本75例，所有病例均未接受術(shù)前放化療等輔助治療，經(jīng)術(shù)后組織病理學檢查明確診斷。其中男42例，女33例;年齡40～87歲，平均（64.7±7.4）歲;病變位于結(jié)腸40例，直腸35例;潰瘍型68例，隆起型7例;其中高分化腺癌1例，中分化腺癌60例，低分化腺癌14例;pT3期56例，pT4a期19例;腫瘤直徑3.0～7.4 cm，平均（4.60±0.73）cm，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。實驗方案均經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會研究通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 HE染色 ?標本經(jīng)10%中性甲醛固定6～24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，每個蠟塊4～5 μm切片，30 min烤片后，二甲苯脫蠟至水，蘇木精染色3～5 min，水洗，伊紅染色2～3 min，水洗，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.2 試劑配制 ?1%地衣紅染液：1 g地衣紅（上海源葉生物科技公司，S19015-5g）溶于99 mL 70%乙醇，然后加入1 mL濃鹽酸，震蕩、過濾，4℃冰箱中保存?zhèn)溆??？辔端犸柡退芤海? g苦味酸粉末（上海源葉生物科技公司，S25563-25g）溶于100 mL水中，室溫中保存?zhèn)溆谩?%酸性品紅水溶液：1 g酸性品紅（上海源葉生物科技公司，S19025-25g）溶于100 mL蒸餾水中，室溫中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 彈力纖維染色 ?采用地衣紅染色法，具體步驟如下：石蠟包埋組織3～4 μm切片后脫蠟至水，放置70%酒精中清洗后置于1%地衣紅染液中過夜，70%酒精充分洗滌30 s，95%酒精分化至顯微鏡下觀察到彈力纖維顯色，放到苦味酸品紅混合液中（1∶30，現(xiàn)用現(xiàn)配）復染1 min，95%酒精中脫水分化3 min，二甲苯透明，封片。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，計數(shù)資料用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VPELI及VI彈力纖維染色形態(tài)學判讀

彈力染色呈現(xiàn)鮮亮的紅棕色，可清晰顯示臟層腹膜彈力層（圖1A，見封四）及血管管壁的彈力纖維（圖1B，見封四）。VPELI判讀標準：①腫瘤組織明確超過臟層腹膜彈力層（圖1C，見封四）;②腫瘤組織致彈力層不清晰時，腫瘤組織位于附近殘存臟層腹膜彈力層水平線之上。VI的形態(tài)學識別包括：①在單個動脈附近存在彈力纖維包繞界限清晰的腫瘤結(jié)節(jié)，且沒有明顯的靜脈（圖1D，見封四）;②圍繞腫瘤的同心圓狀的彈力纖維（圖1E，見封四）;③腫瘤的舌狀突出超出腫瘤組織的下緣進入周圍脂肪（圖1F，見封四）。

2.2 VPELI情況及與不良預后因子的關(guān)系

彈力纖維染色的VPELI檢出率明顯高于HE染色的VPI檢出率（P < 0.05）。見表1。VPELI陽性患者與VPI陽性患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VI、神經(jīng)侵犯及腫瘤出芽發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。VPELI陽性的腫瘤患者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯及腫瘤出芽發(fā)生率高于VPELI陰性的腫瘤患者（P < 0.05），兩者神經(jīng)侵犯情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。臟層腹膜彈力層不存在患者的不良預后因子發(fā)生情況與VPELI陰性患者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），但臟層腹膜彈力層不存在患者神經(jīng)侵犯發(fā)生例數(shù)明顯少于VPELI陽性患者（P < 0.05）。見表3。

2.3 HE染色和彈力纖維染色檢測的血管侵犯情況比較

彈力纖維血管侵犯的檢出率為66.7%，高于HE染色的32.0%（P < 0.05）。見表4。彈力纖維染色檢出血管侵犯的特異性為100.0%（25/25），敏感性為65.8%（50/76）。

3 討論

近年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅我國居民身體健康[1，7]。研究發(fā)現(xiàn)，pT4與pT3期腫瘤比較，患者生存率明顯下降，腫瘤組織是否穿透臟層腹膜是區(qū)分兩者的重要標志[8-9]。相關(guān)研究表明在漿膜破壞的情況下，彈力纖維染色可以顯著提高VPELI的檢出率[10-12]。AJCC肺癌分期中已使用彈力纖維層侵犯代表胸膜侵犯，肺癌組織侵犯超過彈力纖維層或侵犯胸膜表面均可定義臟層胸膜侵犯[13-16]。而結(jié)直腸癌是否能夠使用VPELI代替VPI需要進一步探討。

彈力纖維層侵犯是Ⅱ期結(jié)腸癌復發(fā)的獨立危險因素[17-18]。另有研究證實VPELI陽性的pT3期腫瘤和pT4a期腫瘤預后相似，卻是PT3期腫瘤的不良預后因子[10，19]。與之前結(jié)果類似，在本研究中，彈力纖維染色判讀的VPELI檢出率明顯高于VPI檢出率。同時本研究發(fā)現(xiàn)除神經(jīng)侵犯以外，VPELI陽性腫瘤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VI及腫瘤出芽均具有相關(guān)性。目前VPELI的另一個焦點問題是對于臟層腹膜彈力層無法識別的腫瘤如何判讀和分期。研究證實pT3期腫瘤中未檢出臟層腹膜彈力層病例與VPELI陰性病例相比的上述不良預后因子無顯著性差異，彈力纖維層缺失不影響腫瘤預后的判斷，但是否對腫瘤5年生存率及總體生存率有影響還需進一步觀察[10]。本研究結(jié)果顯示，VPELI陽性患者與臟層腹膜彈力層不存在患者比較，其神經(jīng)侵犯發(fā)生率明顯增高;而VPELI陰性患者與臟層腹膜彈力層不存在患者比較，這4種不良預后因子發(fā)生率均無明顯差異。因此與VPI相比VPELI的侵犯能夠更加客觀地提示腫瘤的預后并指導腫瘤治療用藥，而對于彈力纖維層侵犯是否等同或者能夠替代VPI影響結(jié)直腸的分期，還需要通過大樣本研究尋找更多的科學證據(jù)進行驗證。

結(jié)直腸癌的AJCC指南指出血管受侵是獨立于現(xiàn)有的Dukes分期/pTNM分期而影響患者預后的一項十分重要的檢測指標[20]。本研究結(jié)果提示彈力纖維染色可以顯著提高VI檢出率，這與相關(guān)學者等[6，18]的研究發(fā)現(xiàn)一致。

總之，本研究結(jié)果提示彈力纖維染色可以有效地提高結(jié)直腸癌VPELI和VI的檢出率，VPELI陽性腫瘤患者提示預后不良。彈力纖維染色可能為結(jié)腸癌分期及預后提供更有價值的參考，VPELI在結(jié)腸癌病理分期及預后評估方面將起到更加重要的作用。

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