張軍 董雅璐

[摘要] 目的 探索靶向間皮素（MSLN）嵌合抗原受體改造的NK-92細胞在胃癌中的抗腫瘤活性。 方法 構(gòu)建靶向MSLN的二代嵌合抗原受體，利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式將其導(dǎo)入NK-92細胞中得到MSLN CAR-NK-92細胞。通過免疫組化分析、流式細胞術(shù)及Western blot實驗檢測人胃癌腫瘤組織、人胃癌細胞中MSLN的表達情況。通過體外激活及體內(nèi)腫瘤抑制實驗研究CAR-NK-92細胞的特異性識別能力和抗腫瘤活性。 結(jié)果 人胃癌腫瘤組織及腫瘤細胞中高表達MSLN。CAR-NK-92細胞可以特異性激活并裂解腫瘤細胞。與轉(zhuǎn)染空載體的NK-92細胞比較，CAR-NK-92細胞可以明顯抑制胃癌腫瘤的生長（P < 0.01）。 結(jié)論 構(gòu)建的靶向MSLN的CAR-NK-92在體內(nèi)外都展現(xiàn)出顯著的特異性殺傷MSLN+的胃癌細胞的活性，將有可能在胃癌的治療中提供新的思路。

[關(guān)鍵詞] 胃癌;間皮素;NK-92細胞;免疫治療

[中圖分類號] R730.51 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0011-05

[Abstract] Objective To explore the antitumor activity of NK-92 cells modified with chimeric antigen receptor targeting mesothelin （MSLN） in gastric cancer. Methods The second generation chimeric antigen receptor targeting MSLN was constructed and transfected into NK-92 cells by lentivirus transfection to obtain MSLN CAR-NK-92 cells. The expression of MSLN in human gastric cancer tissues and human gastric cancer cells was detected by immunohistochemistry， flow cytometry and Western blot. The specific recognition ability and the anti-tumor activity of CAR-NK-92 cells were studied through in vitro activation and in vivo tumor inhibition experiments. Results MSLN was highly expressed in human gastric cancer tissue and tumor cells. CAR-NK-92 cells could specifically activate and lyse tumor cells. Compared with NK-92 cells transfected with an empty vector， CAR-NK-92 cells can significantly inhibited the growth of gastric cancer （P < 0.01）. Conclusion CAR-NK-92 targeting MSLN has shown significant activity in vivo and in vitro to kill gastric cancer cells specific to MSLN+， which may provide a new idea in the treatment of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer; Mesothelin; NK-92 cell; Immunotherapy

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，每年約有100萬新診斷病例[1-2]。CAR修飾的淋巴細胞是一種很有前途的免疫治療方法[3]。目前T細胞、NK細胞代表了另一種可以用CAR改造的高度有效的效應(yīng)細胞類型，同種異體NK細胞過繼轉(zhuǎn)移安全性高[4]，但培養(yǎng)相對困難[5]。NK-92細胞是目前比較理想的原代NK細胞替代品[6]，其安全性和有效性已被證實[7]。此外，一項早期的臨床試驗證實輸注經(jīng)過輻射的NK-92細胞具有良好的耐受性，并且部分接受治療的癌癥患者得到了長時間的疾病緩解[8]，這使得NK-92細胞成為CAR工程化的一個極具希望的選擇[9]。

本研究首先設(shè)計了靶向間皮素（MSLN）的二代CAR來改造NK-92細胞，以探究這種MSLN CAR-NK-92細胞是否會對胃癌產(chǎn)生顯著的抗腫瘤活性。隨后選擇在實體瘤中高表達MSLN作為靶標[10-11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向MSLN的CAR-NK-92細胞可以在體外充分激活并裂解MSLN+胃癌細胞。體內(nèi)實驗顯示這種CAR-NK-92細胞可以顯著抑制MSLN+胃癌腫瘤生長。本研究顯示靶向MSLN的CAR-NK-92細胞可以為胃癌的治療提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

MGC803細胞、BGC-823細胞、AGS細胞、SGC-7901細胞購自美國模式菌種庫;NK-92細胞購自上海細胞庫。MGC803細胞、BGC-823細胞、SGC-7901細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，AGS細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，NK-92細胞培養(yǎng)在添加5%人AB血清的X-VIVO 10培養(yǎng)基中。

Poly-brane購自Sigma公司（美國，P8136）;BX795購自InvivoGen公司（法國，S49953）;抗-MSLN免疫組化抗體購自R&D公司（AF3256）;抗MSLN（594004）及CD107a（121607）流式抗體購自美國Biolegend公司;LDH檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司（中國，C0016）;化學(xué)發(fā)光試劑盒購自萬類生物（中國，WLA003）;山羊抗兔二抗（LK-GAM0072）及GAPDH一抗（70-Mab5465-040）購自聯(lián)科生物科技有限公司。

1.2 MSLN CAR載體的構(gòu)建

MSLN CAR的結(jié)構(gòu)如文獻[10]研究所述。在胞外區(qū)包含Anti-MSLN scFv及CD8鉸鏈區(qū)，緊隨其后的是CD8的跨膜區(qū)、胞內(nèi)的4-1BB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CAR序列被整合到含有綠色熒光蛋白的表達載體中，綠色熒光蛋白序列與CAR序列以T2A位點分隔。另外一個只編碼綠色熒光蛋白的空載體作為對照。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染NK-92細胞

轉(zhuǎn)染前1 d，在6孔板中將NK-92細胞密度調(diào)整為1×105個/mL，加入X-VIVO 10培養(yǎng)基;第2天，細胞與慢病毒顆粒（MOI為2）、Poly-brane（8 μg/mL）和激酶抑制劑BX795（8 μmol/L）混合（這兩種試劑都被證明能提高NK細胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率）。6孔板離心60 min（32℃，1800×g），37℃孵育6 h，離心除去轉(zhuǎn)染混合物（360×g離心5 min），換成2 mL新鮮的X-VIVO 10培養(yǎng)基;次日，將NK-92細胞接種于含慢病毒顆粒、Poly-brane和BX795的5 mL培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，37℃孵育;次日重復(fù)第3次轉(zhuǎn)染。通過流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白的表達來評價轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。對于轉(zhuǎn)染CAR載體的NK-92細胞，命名為CAR-NK-92細胞，對于轉(zhuǎn)染空載體的NK-92細胞，命名為Control NK-92細胞（C-NK-92細胞）。

1.4 流式細胞術(shù)

對于流式細胞檢測MSLN，4種腫瘤細胞（mGC803細胞、BGC-823細胞、SGC-7901細胞、AGS細胞）分別通過離心獲得所有細胞，用FACS洗滌緩沖液（含有0.5% BSA和0.03%疊氮化鈉的1×PBS）洗滌3次。用針對抗MSLN的流式抗體進行細胞表面染色，避光孵育30 min，用FACS洗滌緩沖液洗3次，進行流式細胞分析。

對于NK細胞激活實驗，將構(gòu)建好的CAR-NK-92細胞與MGC803細胞及SGC-7901共孵育6 h，通過抗人CD107a抗體檢測CAR-NK-92細胞上的CD107a的表達。所有樣本在LSR Ⅱ細胞儀（BD Biosciences）上進行操作，使用FACS DIVA軟件v8.0（BD Biosciences）進行分析。

1.5 Western blot檢測

在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中分別裂解MGC803細胞、BGC-823細胞、AGS細胞、SGC-7901細胞。通過12% SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白質(zhì)。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%脫脂乳中封閉，并在4℃下與MSLN抗體一抗（1∶500）孵育過夜。TBST洗滌3次后，將膜與HRP綴合的山羊抗兔二抗（1∶10 000）在室溫下孵育2 h。增強型化學(xué)發(fā)光分析試劑盒對PVDF膜進行處理，ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)（BIO-RAD）進行曝光。通過使用Image J對條帶的強度進行量化。GAPDH為同型對照。

1.6 免疫組化分析

腫瘤組織樣本來自新疆軍區(qū)總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）接收的胃癌患者，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋切片，并在二甲苯中脫蠟。切片在0.3%的過氧化氫（H2O2）-甲醇溶液中浸泡30 min，PBS洗滌，在4℃用抗MSLN的單克隆抗體孵育過夜。使用緩沖液洗滌后，將石蠟切片與生物素標記的山羊抗兔或抗鼠IgG在室溫下孵育2 h。免疫染色用鏈霉親和素/過氧化物酶復(fù)合物和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染。在倒置顯微鏡下的明場下觀察并拍照。

1.7 細胞毒性實驗

分別取1×104個腫瘤細胞進行鋪板，以2∶1的效靶比在37℃條件下與效應(yīng)細胞共孵育24 h。測量乳酸脫氫酶（LDH）反映細胞毒性。實驗組和對照組根據(jù)制造商的方案設(shè)計。Multiskan FC酶標儀（THERMO FISHER），檢測490 nm處的吸光度來確定樣品中的LDH活性;計算T細胞的細胞毒性，裂解率（%）=（實驗組吸光度-效應(yīng)細胞自發(fā)裂解吸光度-靶細胞自發(fā)裂解吸光度-培養(yǎng)基對照吸光度）/（靶細胞最大裂解吸光度-靶細胞自發(fā)裂解吸光度-培養(yǎng)基對照吸光度）×100%。

1.8 體內(nèi)實驗

5～7周齡的雌性SPF級balb/c裸鼠，16～18 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心，共計10只，許可證號：SCXK（新）20190002，合格證號：SYXK（新）20190014。在標準無菌室中飼養(yǎng)，每日監(jiān)測，健康狀況良好。所有方案均經(jīng)我院動物護理和使用委員會批準（IACUC編號：2019倫審第006號）進行。通過對小鼠皮下注射1×106個MGC803細胞建立異種移植模型。接種后7 d，通過尾靜脈給予5×106 C-NK-92細胞和CAR-NK-92細胞，每組5只小鼠，之后每7天測量腫瘤長寬，計算體積，體積=（長×寬2）/2。在接瘤后第32天處死小鼠剝離腫瘤，拍照記錄腫瘤大小并稱量瘤重。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSLN CAR-NK-92細胞的構(gòu)建和檢測

CAR結(jié)構(gòu)由MSLN scFv，CD8鉸鏈及跨膜區(qū)，4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域及CD3ζ構(gòu)成，載體中包含EGFP作為檢測標簽，見圖1A（封四）;細胞流式檢測結(jié)果顯示，C-NK-92細胞與CAR-NK-92細胞都顯著表達增強型綠色熒光蛋白（EGFP），見圖1B（封四），轉(zhuǎn)染效率為40%左右，見圖1C（封四）。

2.2 MSLN在人原發(fā)性胃癌組織中的表達分析

免疫組化結(jié)果顯示，胃癌患者的腫瘤組織中高表達MSLN，見圖2A;胃癌細胞流式檢測結(jié)果顯示，MGC803及BGC-823細胞顯著高表達MSLN，AGS細胞表達量適中，而SGC-7901細胞幾乎不表達MSLN，見圖2B;Western blot結(jié)果驗證了流式檢測的結(jié)果，見圖2C。

2.3 CAR-NK-92細胞表面CD107a的表達結(jié)果

效應(yīng)細胞與MGC803細胞共孵育時，CAR-NK-92細胞表面CD107a表達高于NK-92細胞，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 32.59，P < 0.01）;而與SGC-7901細胞共孵育時，CAR-NK-92細胞表面CD107a的表達與NK-92細胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 MSLN靶向的CAR-NK-92細胞在不同效靶比下對胃腫瘤細胞的特異性細胞毒作用

當靶細胞為MSLN陽性的腫瘤細胞時，隨著效靶比的增加，CAR-NK-92細胞毒性也隨之增強;而對于MSLN陰性的SGC-7901細胞，在多種效靶比下均不能有效裂解靶細胞。而對于C-NK-92細胞，在任何條件下都不能產(chǎn)生明顯的細胞毒性。見圖4。

2.5 MSLN靶向的CAR-NK-92細胞對來自MSLN+胃癌細胞系的異種移植瘤的抗腫瘤效果

小鼠皮下移植瘤瘤體積監(jiān)測結(jié)果顯示，CAR-NK-92細胞明顯抑制腫瘤的生長，而C-NK-92細胞對腫瘤的生長沒有抑制能力，組間比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 33.89，P < 0.01），見圖5A。接瘤后第32天處死小鼠剝離腫瘤發(fā)現(xiàn)，CAR-NK-92細胞治療后的小鼠瘤重顯著低于C-NK-92細胞（t = 5.571，P < 0.01），見圖5B～C。

3 討論

已有臨床實驗將CAR-T細胞應(yīng)用于胃癌患者的治療[12]，然而CAR-T細胞在實體瘤患者中響應(yīng)率仍然很低。這些挑戰(zhàn)主要與CAR-T細胞向腫瘤部位遷移效率低以及免疫抑制微環(huán)境有關(guān)[13]。除了T細胞，NK細胞的使用在近年來成為了一種非常有前途的治療方法。然而，自體NK細胞的抗腫瘤效力是有限的，因為它們的活性在遇到自身抗原后可以被抑制[14]。因此，大多數(shù)現(xiàn)存的治療方法都是基于供者來源的同種異體NK細胞或已建立的NK細胞系[15]。

本研究使用了人NK-92細胞系，因為其具有無限的擴增潛力和對癌細胞的細胞毒性。臨床前研究顯示，NK-92細胞或工程化的NK-92細胞在體外和體內(nèi)模型中對包括血液惡性腫瘤和實體瘤在內(nèi)的各種癌癥有效[16]。此外，已證明用CAR改造的NK-92細胞可以克服腫瘤微環(huán)境中的抑制條件[17]。使其成為臨床轉(zhuǎn)化的一個有吸引力的選擇。

MSLN是極少數(shù)可用于免疫細胞治療的靶點之一[10]，并開展了多項臨床試驗[18]。研究結(jié)果顯示，MSLN在胃癌患者腫瘤組織中高表達，在多種胃癌細胞中也顯著高表達。體內(nèi)外抗腫瘤活性實驗也顯示，靶向MLSN的CAR-NK-92細胞可以有效殺傷胃癌細胞，抑制腫瘤生長。

NK細胞對惡性細胞有天然的感知能力，它不會像T細胞一樣在腫瘤微環(huán)境中分化為抑制性的調(diào)節(jié)性T細胞，這些特性也許可以使得CAR-NK細胞對實體瘤產(chǎn)生更強的抗腫瘤活性。NK-92除了缺乏FcγRⅢ（CD16RⅢ）的表達外，還具有與激活的外周血NK細胞相似的特征[19]。因此，CAR-NK-92細胞更是成為一種非常有前途的治療手段[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，相信靶向MSLN的CAR-NK-92可以為胃癌的治療提供新的策略。

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（收稿日期：2020-04-01）