簡詠男 鄭文蘭

[摘要] 目的 探討人輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)的方法與鑒定。 方法 取在貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院部住院的早期輸卵管妊娠3例患者的絨毛組織，采用膠原酶-胰酶混合消化法消化細胞，差速貼壁法純化分離細胞，最后通過免疫熒光共聚焦方法對培養(yǎng)出的細胞進行細胞鑒定。 結(jié)果 免疫熒光雙標記染色檢測到角蛋白與波形蛋白共表達。 結(jié)論 通過顯微鏡和免疫熒光檢測細胞外形和骨架，初步判定該細胞可能為滋養(yǎng)細胞。

[關(guān)鍵詞] 滋養(yǎng)細胞;原代培養(yǎng);細胞鑒定;胎盤絨毛;胰酶消化

[中圖分類號] R711 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the methods and identification of tubal pregnancy trophoblasts in vitro. Methods The villi of 3 patients with early tubal pregnancy admitted to the Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine were taken. Collagenase-trypsin mixed digestion method was used to digest cells， and differential adherence method was used to purify and isolate cells. Finally， the cells were identified by immunofluorescence confocal method. Results Co-expression of keratin and vimentin was detected by immunofluorescence double-labeling staining. Conclusion Microscope and immunofluorescence can detect cell shape and skeleton. It is preliminarily determines that the cell may be a trophoblast cell.

[Key words] Trophoblast cell; Primary culture; Cell identification; Placental villi; Trypsin digestion

近年來，異位妊娠發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢，且逐年上升，為保留治療后輸卵管的完整性，提高今后的再次受孕率，中藥治療因其副作用小而備受人們關(guān)注，且在臨床治療中也取得了滿意的效果，但其機制研究尚處于初級階段。由于在人體無法進行相關(guān)的在體研究，因此輸卵管妊娠絨毛滋養(yǎng)細胞的體外培養(yǎng)便成為進行相關(guān)實驗研究的前提。本研究將早期的人輸卵管妊娠患者的絨毛組織進行體外培養(yǎng)，為后期輸卵管妊娠疾病的相關(guān)研究提供較好的模型，為推動中藥治療異位妊娠滋養(yǎng)細胞疾病提供良好的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 絨毛組織

選取在貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院部住院的早期輸卵管妊娠患者3例，妊娠周數(shù)為孕5～8周，平均（6.33±0.58）周;孕婦年齡20～30歲，平均（26.67±2.08）歲;無其他疾病;未經(jīng)藥物治療;直接手術(shù)的輸卵管妊娠患者的新鮮絨毛組織?；颊弑救藢Ρ狙芯恐橥?。

1.2 主要試劑及儀器

膠原酶Ⅰ（貨號：C8140）、DAPI染色液（貨號：C0065）、5%BSA封閉液（貨號：SW3015）、曲拉通X-100（貨號：T8200）：北京索萊寶生物科技有限公司;PBS緩沖液（貨號：SH30256.01）、胰酶消化液（貨號：SH30042）、胎牛血清（貨號：SH30406.02E）：美國HyClone;異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人角蛋白18（貨號：bs-2043R）、熒光素（Cy3）標記的鼠抗人波形蛋白（貨號：bs-0756R）：北京博奧森生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛（貨號：DF0135）：安徽雷根生物技術(shù)有限公司;倒置顯微鏡（型號：BX41TF）：日本Olympus;激光共聚焦顯微鏡（型號：DM4000B）：德國Leica;高速冷凍離心機（型號：Microfuge 20R）：美國Beckman Coulter。

1.3 滋養(yǎng)細胞的取材及培養(yǎng)

根據(jù)文獻[1]將輸卵管妊娠的絨毛組織在無菌條件下置于含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS中，取樣1 h內(nèi)冰上運送至實驗室。于超凈工作臺內(nèi)，PBS反復(fù)洗滌絨毛組織以去除血污，眼科剪將組織剪碎至1 mm3左右，收集至離心管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清，加入0.125%胰酶+0.1%Ⅰ型膠原酶1∶1復(fù)合消化液，37℃水浴中將其消化20 min。消化完畢后加入10%胎牛血清（FBS）終止消化，離心，棄上清。加入含20%FBS的培養(yǎng)液懸浮細胞，反復(fù)吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，放置在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h首次換液，以后每隔48 h常規(guī)換液 1次。

1.4 差異貼壁法分離滋養(yǎng)細胞

當(dāng)細胞貼壁生長至80%～90%時，吸去培養(yǎng)液，PBS洗后加入0.25%胰酶消化細胞并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育5 min，加入10%FBS終止消化，1000 r/min，離心5 min，棄上清。鋪入新的培養(yǎng)瓶中，加20%FBS培養(yǎng)液3 mL，輕輕吹打后，于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置20 min，采用差速貼壁法將其進行分離純化，在顯微鏡下觀察到最先貼壁的為成纖維細胞，滋養(yǎng)細胞大多為懸浮細胞，將其懸浮的培養(yǎng)液收集于另一培養(yǎng)瓶中，重復(fù)5次后鋪瓶，放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5 倒置顯微鏡觀察

觀察細胞貼壁時間、細胞生長形態(tài)、原代生長周期。待細胞長到80%～90%時，用胰酶消化傳代。

1.6 人輸卵管妊娠絨毛滋養(yǎng)細胞的鑒定

將第4次傳代的滋養(yǎng)細胞，計數(shù)板計數(shù)，以2×106個/mL的濃度接種于激光共聚焦皿中，24 h后，用PBS清洗，加入4%多聚甲醛，室溫下固定15 min。PBS洗3次后，用0.1%曲拉通X-100增加細胞膜通透性，PBS洗滌細胞3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h;去血清后滴加1∶1混合的異硫氰酸熒光素（FITC）標記抗人細胞角蛋白18（CK18）、熒光素（CY3）標記抗人波形蛋白各25 μL，4℃孵育過夜。次日取出后復(fù)溫，用PBS重復(fù)洗滌細胞3次后滴加DAPI染核，避光室溫下染色后加入PBS沖洗3次，激光共聚焦顯微鏡檢測該體外培養(yǎng)的細胞角蛋白和波形蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 滋養(yǎng)細胞一般形態(tài)

原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞接種后于倒置顯微鏡下可見大量圓形細胞懸浮存在，1 h后細胞開始慢慢貼壁，有個別細胞開始伸展，24 h后可明顯見大部分細胞已經(jīng)貼壁，48 h后大部分細胞伸展，到第9、10天細胞的數(shù)量明顯變多，可見細胞呈扁平不規(guī)則的三角形或多邊形，片狀平鋪生長，核較圓，胞質(zhì)豐富，部分細胞連接成片，少量細胞呈長梭形。見圖1。14 d長到80%～90%可傳代，傳代后3～4 d為1代。

2.2 人輸卵管妊娠絨毛滋養(yǎng)細胞的鑒定

免疫熒光雙標記檢測結(jié)果顯示：在細胞質(zhì)中出現(xiàn)角蛋白和波形蛋白共表達的黃色部位。見圖2（封四）。

3 討論

目前，細胞體外培養(yǎng)的技術(shù)已成為研究滋養(yǎng)細胞相關(guān)疾病的重要手段，其關(guān)鍵步驟在于人滋養(yǎng)細胞體外分離的培養(yǎng)成功。妊娠期滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)、分離純化、傳代培養(yǎng)和細胞鑒定4個階段[2]。

本研究選取20～30歲女性，5～8周內(nèi)早期輸卵管妊娠患者。為提取活力較強的滋養(yǎng)細胞，應(yīng)盡可能地選擇青年女性[3]，以便提高滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)的成功率。

取回胎盤組織后，用PBS緩沖液認真清洗，清除明顯的血塊及筋膜組織后，剪取絨毛，使其絨毛組織完全剪碎至糊狀后進行消化分離。目前原代培養(yǎng)的分離方法主要分為組織塊法和酶消化法2種[4]。組織貼塊法操作簡單，但原代細胞生長周期較長，需20 d左右，細胞純度低且容易污染[5]，因此，該方法不建議用于滋養(yǎng)細胞的體外培養(yǎng)。胰蛋白酶消化法包括單一胰蛋白酶消化法和復(fù)合酶消化法，一般的酶消化法雖然能夠快速地得到大量的細胞，但容易混入成纖維細胞且在反復(fù)消化細胞的同時對細胞的損傷比較大[6]，而膠原酶比較溫和，還可以幫助分解間質(zhì)細胞，但對上皮細胞影響不大[7]。故本研究選用膠原酶-胰酶混合消化法來消化細胞。

滋養(yǎng)層細胞的分離無論是采用組織塊法或是酶消化法，細胞懸液里面都會含有血管內(nèi)皮細胞、Hofbauer細胞、成纖維細胞及血細胞等[8]，故排除其他雜質(zhì)細胞的污染是純化滋養(yǎng)細胞的關(guān)鍵。因血管內(nèi)皮細胞、Hofbauer細胞及血細胞等不屬于貼壁細胞，多次換液中就可以去除。而成纖維細胞的貼壁能力較滋養(yǎng)細胞強，其具有先貼壁的特性，為提高其純化度及分離細胞的簡便，本研究采用差速貼壁法。也有很多研究者采用的是Percoll密度梯度分離法，其中，最為成熟的是Kliman等[9]發(fā)現(xiàn)的Percoll密度梯度分離法。Percoll本質(zhì)上是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮化學(xué)加工的硅膠顆粒，雖然其具有密度高、不穿透細胞、無毒害等特點[10]，但該方法操作繁瑣、試劑消耗成本大，在普通實驗室難以推廣。

最后，所獲得的細胞是不是滋養(yǎng)細胞還需要做細胞鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，該細胞在顯微鏡下呈不規(guī)則三角形或多邊形，平鋪整個視野，其生長形態(tài)與滋養(yǎng)細胞相吻合。但顯微鏡下細胞的一般形態(tài)描述不能用于細胞定性，細胞鑒定還需檢測細胞骨架。目前滋養(yǎng)細胞的鑒定沒有統(tǒng)一的標準，細胞角蛋白與波形蛋白的分析比較，是界內(nèi)較為認可的鑒別方法[11]。波形蛋白是間質(zhì)細胞的標志蛋白[12]，而細胞角蛋白，因其獨特的細胞結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成上皮細胞骨架的特有蛋白[13]。徐娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細胞只特異性表達細胞角蛋白。故可借此來辨別滋養(yǎng)細胞和間質(zhì)細胞等其他細胞。

本研究采用了直接免疫熒光雙標記染色法檢測細胞中角蛋白和波形蛋白表達。結(jié)果顯示，在細胞質(zhì)中，存在CK18和波形蛋白共表達部位。近年來文獻報道[15]顯示，上皮細胞也可以表達波形蛋白，因此，波形蛋白表達陽性并不能否認該體外培養(yǎng)的細胞不是滋養(yǎng)細胞，有可能該細胞在體外培養(yǎng)的過程中，細胞性狀發(fā)生了改變，向間質(zhì)細胞方向轉(zhuǎn)化了。近些年也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一些滋養(yǎng)細胞中，也存在波形蛋白表達陽性[16-17]。但因文獻時間較久，故此體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞未用于后期的實驗研究。據(jù)文獻報道[18]體外培養(yǎng)所得的原代細胞產(chǎn)量高，生長周期短，7 d左右可生長成片，本研究結(jié)果顯示原代細胞經(jīng)過14 d培養(yǎng)后才可進行初次傳代，與文獻報道略有出入。筆者分析其細胞活力、胰酶濃度、消化時間、實驗室環(huán)境及操作人員均可能成為影響細胞生長的因素，均可能影響其研究結(jié)果，每一步驟掌控不好都有可能造成活細胞的變性。在分離純化的過程中，有些組織和細胞耐受性較差，也會損害細胞的結(jié)構(gòu)，從而影響細胞的生長時間或貼壁細胞變性[19-22]。因此在研究中需注意的一些問題：①取材患者的年齡越小，組織越新鮮，更容易增加培養(yǎng)成功率，獲得數(shù)量更多更純的滋養(yǎng)細胞[23]。②獲取組織時，絨毛分支稠且送往實驗室時間短，則培養(yǎng)時更易得到數(shù)量更多活力更好的細胞。③使用胰蛋白酶消化傳代時，應(yīng)注意胰酶的用量，而且消化時間不能太長，以免喪失部分細胞;其次，細胞傳代應(yīng)保持同等時間間隔。④胰蛋白酶應(yīng)時用時配，新鮮胰蛋白酶消化細胞的能力強于配制時間長的胰蛋白酶。⑤滋養(yǎng)細胞貼壁時間較長，首次換液時間一般為16～24 h，以后常規(guī)換液時間最好不超過2 d，以免培養(yǎng)基營養(yǎng)成分耗盡造成細胞死亡。⑥絨毛組織越碎，細胞消化就會更加充分。

綜上，結(jié)合顯微鏡和免疫熒光的結(jié)果，初步判定此體外培養(yǎng)的細胞可能為滋養(yǎng)細胞。如何獲得數(shù)量豐富且純度較高的滋養(yǎng)細胞仍是目前研究的熱點，如能進一步研究出該細胞更多的生長特性和其他標志性的指標，將為各種滋養(yǎng)細胞相關(guān)疾病提供實驗基礎(chǔ)，為廣大患者帶來福音。

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（收稿日期：2020-01-08）