龔攀 曾玉 鄺燕好 陳凱

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510095;2廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科)

我國(guó)牙周疾病的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于齲病，牙周炎是牙周病中較為常見的類型，其中約95%為慢性牙周炎〔1〕。慢性牙周炎的發(fā)病率隨著年齡的升高而呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。慢性牙周炎是由于牙周微生物在牙周定植、繁殖、入侵，損害宿主相關(guān)牙周組織，引發(fā)免疫反應(yīng)，甚至導(dǎo)致全身炎癥性反應(yīng)〔2，3〕。慢性牙周炎牙齦炎癥逐步向深部組織進(jìn)展，造成牙周組織破壞，導(dǎo)致牙周袋的形成，并隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致牙齦退縮、牙齒松動(dòng)、牙周膿腫等一系列臨床癥狀〔4，5〕。齦溝液主要來源于齦下菌斑、細(xì)菌、宿主代謝產(chǎn)物及血清，其成分的組成及量的變化可有效反映牙周組織狀態(tài)〔6〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-8是牙周炎主要膠原酶，可引起Ⅰ型膠原發(fā)生降解，Ⅰ型膠原是包括牙周膜、牙齦、牙槽骨在內(nèi)的牙周軟硬組織的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分〔7，8〕。Sonic Hedgehog(Shh)蛋白是Hh蛋白家族成員之一，其信號(hào)通路與細(xì)胞炎癥因子有關(guān)，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生中具有重要作用〔9〕。本研究探討Shh蛋白、MMP-8在老年慢性牙周炎患者齦溝液中的表達(dá)水平，分析其與炎癥程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1一般資料 回顧性選取廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2018年6月至2019年3月90例老年慢性牙周炎患者，根據(jù)牙齦指數(shù)(GI)、探診深度(PD)、附著喪失(AL)、X 線片顯示牙槽骨吸收程度(ABL)進(jìn)行分組，其中輕度組29例，中度組31例，重度組30例，另選取牙周健康志愿者30例作為對(duì)照組。對(duì)照組男19例，女11例；年齡60～72歲，平均(66.92±2.71)歲；輕度組男17例，女12例；年齡61～73歲，平均(66.80±2.08)歲；中度組男20例，女11例；年齡60～74歲，平均(66.91±1.85)歲；重度組男17例，女13例；年齡60～73歲，平均(66.88±2.14)歲。四組性別與年齡無顯著差異(P>0.05)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) (1)慢性牙周炎符合《牙周病學(xué)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔10〕；(2)年齡≥60歲；(3)無與牙周炎相關(guān)的全身性疾病或慢性疾??；(4)無吸煙及酗酒史；(5)口腔存留牙≥20顆；(6)近3 個(gè)月內(nèi)未使用過抗生素治療；(7)近1年內(nèi)未接受過牙周治療。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并高血壓、糖尿病、心臟疾病等；(2)侵襲性牙周炎者；(3)齦溝液收集的牙位頸部分存在齲、修復(fù)體、充填物等；(4)長(zhǎng)時(shí)間使用激素、抗生素、免疫抑制劑；(5)正畸治療史；(6)1年內(nèi)使用過牙周藥物或進(jìn)行過手術(shù)治療；(7)根尖片顯示頸部無任何牙體病變。

1.4輕、中、重度牙周炎診斷與分組標(biāo)準(zhǔn)〔11〕由同一名牙周科醫(yī)師進(jìn)行除第三磨牙以外的全口牙周情況進(jìn)行檢查。檢查內(nèi)容：PD、AL、GI、ABL。每顆牙選擇頰、舌側(cè)正中、近中、遠(yuǎn)中檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)，取平均值作為最終測(cè)量結(jié)果。 對(duì)照組：GI=0，PD≤3 mm，未出現(xiàn)附著喪失或牙槽骨吸收；輕度組：GI>1，PD<4 mm，AL為1～2 mm，牙槽骨ABL不超過根長(zhǎng)1/3，牙松動(dòng)現(xiàn)象不明顯。中度組：GI>1，PD 4～6 mm，AL為3～4 mm，牙槽骨水平或角形1/3≤ABL≤1/2，牙出現(xiàn)輕度的松動(dòng)，多根牙存在輕度的根分叉病變。重度：GI>1，PD>6 mm，AL≥5 mm，牙槽骨ABL>根長(zhǎng)的1/2，根分叉存在明顯病變，牙出現(xiàn)多處松動(dòng)。

1.5齦溝液的采集 使用0.5 ml的無菌EP管，采用3號(hào)Whatman濾紙裁成適中大小，徹底消毒后，將每3張濾紙條放入1根Ep管，記錄總重量。收集患者齦溝液，于最深的單根牙近中頰側(cè)采集，樣品均在固定時(shí)點(diǎn)采集，每位患者采集3份。齦溝液采集之前，需使用無菌刮匙將鄰面上的齦上菌斑及牙石去除，通過氣槍輕輕吹干受試牙牙面，醫(yī)用棉卷隔濕。將濾紙插入牙頰側(cè)近中牙周袋內(nèi)，感受到明顯的阻力后，停留約30 s，取出。若濾紙上有唾液、血漬、菌斑，則舍去重新取樣。

1.6齦溝液中Shh蛋白與MMP-8的提取與檢測(cè) 將含齦溝液的EP管中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)150 μl，震蕩4 min，離心3 000 r/min條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至消過毒的EP管中，做好編號(hào)。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)齦溝液中Shh、MMP-8水平。取原倍標(biāo)準(zhǔn)品150 μl進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品加50 μl樣品，待測(cè)樣品孔首先加入40 μl樣品稀釋液，再加入待測(cè)樣品10 μl，輕輕晃動(dòng)將樣品混勻。封板后置于37℃條件下溫育30 min。將30倍的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍備用。揭掉封板膜后，將液體棄除，甩干，每個(gè)孔中均加滿洗滌液，靜置30 s，棄去，重復(fù)5次后拍干。除空白孔外，每孔加入50 μl酶標(biāo)試劑。加入顯色劑 A、B各50 μl，震蕩混勻，37℃條件下避光顯色處理15 min，每孔加入50 μl終止液。加終止液后15 min，以空白孔調(diào)零，在450 nm波長(zhǎng)條件下依次測(cè)定吸光度(OD 值)。標(biāo)準(zhǔn)物濃度作為橫坐標(biāo)，OD值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值查出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即樣品實(shí)際濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，通過受試者工作特征(ROC)曲線分析預(yù)測(cè)效能，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1慢性牙周炎患者與對(duì)照組Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平比較 慢性牙周炎患者Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 慢性牙周炎患者與對(duì)照組Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平比較

2.2不同炎癥程度患者Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平比較 中度組Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平顯著高于輕度組，重度組Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平顯著高于中度組(P<0.05)。見表2。

表2 不同炎癥程度患者Shh蛋白、MMP-8表達(dá)水平比較

2.3齦溝液中Shh蛋白、MMP-8反映患者炎癥程度效能分析 齦溝液中Shh蛋白、MMP-8聯(lián)合檢測(cè)反映患者輕度與中度炎癥、中度與重度炎癥ROC曲線下面積(AUC)顯著高于單獨(dú)Shh蛋白、MMP-8檢測(cè)(P<0.05)。見表3和圖1。

表3 齦溝液中Shh蛋白、MMP-8反映患者炎癥程度效能分析

圖1 Shh蛋白、MMP-8反映慢性牙周炎患者輕度與中度炎癥、中度與重度炎癥ROC曲線

2.4不同炎癥程度患者牙周指數(shù)比較 輕度組GI、PD、AL、ABL顯著低于中度組，中度組顯著低于重度組(P<0.05)。見表4。

表4 不同炎癥程度患者牙周指數(shù)比較

2.5齦溝液中Shh蛋白、MMP-8與老年慢性牙周炎患者炎癥程度相關(guān)性 齦溝液中Shh水平與GI、PD、AL、ABL均呈正相關(guān)(r=0.421、0.395、0.502、0.518，均P<0.01)；齦溝液中MMP-8水平與GI、PD、AL、ABL均呈正相關(guān)(r=0.522、0.554、0.317、0.437，均P<0.01)。

2.6齦溝液中Shh蛋白、MMP-8水平的相關(guān)性 齦溝液中Shh、MMP-8水平呈正相關(guān)(r=0.469，P<0.01)。見圖2。

圖2 慢性牙周炎患者齦溝液中Shh蛋白、MMP-8水平相關(guān)性

3 討 論

慢性牙周炎是一種牙周菌斑及其產(chǎn)物作用下牙周組織內(nèi)釋放炎癥介質(zhì)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)造成的慢性感染性疾病，主要特征為牙周袋形成、附著喪失、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)〔12〕。老年牙周疾病患者口腔衛(wèi)生狀態(tài)較差，牙齦普遍萎縮，牙周附著喪失多，牙槽骨吸收嚴(yán)重，牙齒松動(dòng)明顯，并常伴有根面暴露、根面齲、食物嵌塞、根分叉病變等，常伴有各種系統(tǒng)性疾病〔13〕。Hh蛋白是一種分泌蛋白，通過一系列裂解與催化修飾后，C端催化結(jié)構(gòu)域可與膽固醇共價(jià)結(jié)合，再和軟脂酰輔酶A反應(yīng)，完成Hh蛋白修飾過程，分泌到細(xì)胞外〔14〕。Shh在胚胎發(fā)育及器官形成中扮演著重要角色，可造成發(fā)育畸形，導(dǎo)致腫瘤、纖維化等的發(fā)生，同時(shí)參與軟骨和成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)，與血管新生相關(guān)，參與多種器官的炎癥損傷、組織修復(fù)、細(xì)胞再生〔15〕。王麗娟等〔16〕研究表明具有抗炎作用的白細(xì)胞介素(IL)-10與Shh蛋白增高呈現(xiàn)正相關(guān)，由此提示Shh蛋白可通過調(diào)節(jié)IL-10水平，發(fā)揮保護(hù)性抗炎作用。Kido等〔17〕研究對(duì)種植體周圍炎患者和健康者齦溝液中的Shh蛋白及IL-6水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，種植體周圍炎患者齦溝液中IL-6與Shh表達(dá)高于健康對(duì)照組，提示Shh參與種植體周圍炎的炎癥反應(yīng)。MMPs家族中MMP-1、MMP-7、MMP-13等多種分子可降解牙槽骨組織中的膠原，進(jìn)一步造成骨結(jié)構(gòu)破壞〔18〕。MMP-8受機(jī)體各種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，正常情況下，MMP-8與MMP抑制劑(TIMPs)協(xié)同生成，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。炎癥發(fā)生時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，大量MMP-8生成并激活。MMP-8激活后，不僅直接降解Ⅰ型膠原纖維，還通過激活其他MMPs形成級(jí)聯(lián)效應(yīng)，增強(qiáng)降解能力〔19〕。與此同時(shí)，MMP-8還可作用于患者破骨細(xì)胞，加強(qiáng)骨吸收，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。

本研究證明了Shh、MMP-8在慢性牙周炎齦溝液內(nèi)存在高分泌和高表達(dá)。de Araújo等〔20〕研究表明齦溝液中MMP-8和有無慢性牙周炎及其嚴(yán)重程度關(guān)系密切。研究證實(shí)〔21〕，慢性牙周炎患者齦溝液中Shh是早期診斷及炎癥程度判斷的良好指標(biāo)，本研究與其一致。齦溝液中Shh、MMP-8聯(lián)合可作為反映慢性牙周炎的敏感指標(biāo)。臨床中可通過檢測(cè)慢性牙周炎患者齦溝液中Shh、MMP-8水平來判斷牙槽骨吸收的活躍程度，后續(xù)可進(jìn)一步研究是否能夠通過抑制Shh、MMP-8的生成來有效抑制骨吸收，控制慢性牙周炎的進(jìn)展。

牙周指數(shù)常被用來評(píng)價(jià)牙周狀態(tài)，隨著牙周炎癥的發(fā)生及炎癥程度的增加，牙周指數(shù)明顯增大。研究表明〔22〕慢性牙周炎患者齦溝液中MMP-8、Shh水平通過有效的牙周治療后明顯降低，與牙周指數(shù)的改善具有一定的關(guān)系。本研究表明Shh、MMP-8與牙周炎嚴(yán)重程度有很大關(guān)聯(lián)。MMP-8參與牙周組織破壞的病理過程，Shh蛋白對(duì)炎癥具有保護(hù)性作用，隨著炎癥加重而增高，提示齦溝液中MMP-8、Shh含量與牙周指數(shù)之間的關(guān)系規(guī)律性變化對(duì)臨床上慢性牙周炎的診斷有一定的指導(dǎo)意義。MMP-8、Shh含量的變化可以作為反映牙周組織破壞和恢復(fù)情況的指標(biāo)，其含量測(cè)定有助于牙周炎的診斷。

綜上，老年慢性牙周炎患者齦溝液中Shh蛋白、MMP-8呈現(xiàn)高表達(dá)，且隨著炎癥程度的升高呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，二者聯(lián)合檢測(cè)可有效反映炎癥程度。