尹雪蓮 楊光 馬東杰 蘇哲君 霍峰 王鵬

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，河北 承德 067000；2秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院手術(shù)室)

口腔鱗癌是一種非常常見的口腔頜面部的惡性腫瘤之一，威脅人類的生命健康安全〔1〕。miRNA為長度在18～25個核苷酸之間的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用受到關(guān)注〔2，3〕。miR-19-3p在多種癌癥表達(dá)失調(diào)，但其在口腔鱗癌中的作用機(jī)制仍需繼續(xù)探索。甲狀腺癌相關(guān)基因(TC)-1位于8p11～12，是一種含106個氨基酸編碼的固有無序蛋白，廣泛表達(dá)多種組織器官中，其在許多信號通路中均起重要作用，例如Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路，且參與許多癌癥的發(fā)展〔4，5〕。但miR-19-3p在口腔鱗癌中與TC-1的相互作用關(guān)系尚未清楚。本研究旨在探討miR-19-3p對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 31例口腔鱗癌癌旁組織和39例口腔鱗癌組織均來自承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2018年2～12月接受外科手術(shù)切除的病例?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。人口腔鱗癌細(xì)胞CAL27、Tca8113均購自美國菌種保藏中心；胎牛血清購自杭州四季青；DMEM培養(yǎng)基購自北京康為世紀(jì)；CCK-8試劑購自日本同仁；胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM3000試劑購自Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自；qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國Corning公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京森貝伽公司；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購自上海碧云天生物研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10 %胎牛血清+1%雙抗)培養(yǎng)人口腔鱗癌細(xì)胞CAL27、Tca8113，在37℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

1.3細(xì)胞分組 將miR-19-3p mimics、miR-NC、pcDNA、pcDNA-TC-1、miR-19-3p+pcDNA、miR-19-3p+pcDNA-TC-1與3倍量的脂質(zhì)體混合均勻，再與CAL27細(xì)胞共培養(yǎng)8 h，添加新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。將其分別標(biāo)記為miR-19-3p組、miR-NC組、pcDNA組、pcDNA-TC-1組、miR-19-3p+pcDNA組、miR-19-3p+pcDNA-TC-1組。用于后續(xù)的qRT-PCR、Western印跡實(shí)驗(yàn)、CCK-8、Transwell實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 將需要檢測的細(xì)胞或充分研磨的組織勻漿用RNA抽提試劑盒提取RNA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA、qRT-PCR試劑盒進(jìn)行miR-19-3p、LRIGl檢測。用2-△△Ct計(jì)算miR-19-3p、LRIGl的表達(dá)。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞TC-1、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、Bax、Bcl-2、E-鈣黏蛋白(cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達(dá) 將待檢測細(xì)胞用裂解液在冰上裂解30 min，提取總蛋白，并進(jìn)行定量、變性。蛋白電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再用2.5%脫脂奶粉室溫封閉處理2 h。加入稀釋過的Ⅰ抗溶液(1∶500～2 000)，4℃孵育12～14 h。加稀釋過的Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗)，37℃ 孵育2 h。最后用ECL加發(fā)光液進(jìn)行顯影曝光。

1.6CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將需要檢測的細(xì)胞調(diào)整至5×105個/ml，取100 μl至96孔板，加入CCK-8反應(yīng)液，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。

1.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 將待檢測的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，再用 500 μl 結(jié)合緩沖液懸浮，按照 Annexin V-/FITC試劑盒要求操作，加入染色液，最后上流式細(xì)胞儀檢測分析凋亡情況?？偟蛲雎?%)為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。每個樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.8Transwell小室檢測細(xì)胞遷移侵襲 將待檢測細(xì)胞按106個/孔接種細(xì)胞6孔板，用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。再將細(xì)胞調(diào)至105個/ml，取100 μl平鋪在小室的上表面，600 μl含血清的培養(yǎng)基加入小室的下室，將小室在37℃反應(yīng)12 h。取出小室，除去上室膜上的細(xì)胞，再用甲醇固定、結(jié)晶紫染色。然后再顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量并計(jì)數(shù)，取平均值。

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞熒光活性 根據(jù)mircode在線網(wǎng)站(http：//www.mircode.org/)預(yù)測到的miR-19-3p與TC-1之間的結(jié)合位點(diǎn)，化學(xué)合成野生型TC-1基因序列(TC-1-WT)和突變型TC-1序列(TC-1-MUT)，并將其克隆到熒光載體psiCHECK-2，建立熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA。將其與miR-NC、miR-19-3p共轉(zhuǎn)染。按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊要求操作。結(jié)果用海腎熒光素活性與螢火蟲熒光活性的比值表達(dá)細(xì)胞的熒光活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用PEMS2.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-19-3p在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 與癌旁組織(1.13±0.08)相比，口腔鱗癌組織中miR-19-3p表達(dá)(0.28±0.02)顯著降低(t=63.995,P=0.000)。

2.2miR-19-3p過表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27、Tca8113增殖的影響 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27、Tca8113細(xì)胞中miR-19-3p表達(dá)上調(diào)，CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)，P21蛋白表達(dá)升高，24、48、72 h細(xì)胞活性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。選用miR-19-3p過表達(dá)作用效果較明顯的細(xì)胞CAL27做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 miR-19-3過表達(dá)對細(xì)胞CAL27、Tca8113增殖的影響

圖1 miR-19-3p過表達(dá)對增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-19-3p過表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27細(xì)胞中miR-19-3p、Bax蛋白上調(diào)，Bcl-2蛋白下調(diào)，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，圖3，表2。

圖2 miR-19-3p過表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27凋亡的影響

圖3 miR-19-3p過表達(dá)對Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

表2 miR-19-3過表達(dá)對細(xì)胞CAL27凋亡的影響

2.4miR-19-3p過表達(dá)對CAL27遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖4，圖5，表3。

圖4 miR-19-3p過表達(dá)對細(xì)胞CAL27遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖5 miR-19-3p過表達(dá)對E-cadherin、MMP-2表達(dá)的影響

表3 miR-19-3p過表達(dá)對細(xì)胞CAL27遷移、侵襲的影響

2.5miR-19-3p靶向調(diào)控TC-1 miRcode在線預(yù)測網(wǎng)站顯示，miR-19-3p與TC-1之間存在互補(bǔ)的核苷酸序列(圖6)。與miR-NC組(1.12±0.08、1.08±0.09)相比，miR-19-3p組WT-TC-1細(xì)胞的熒光活性(0.35±0.02)明顯下調(diào)(t=22.872，P=0.000)，MUT-TC-1(1.02±0.07)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.289，P=0.226)；與miR-NC組相比，miR-19-3p組細(xì)胞TC-1 mRNA和蛋白均顯著下調(diào)，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-19-3p組細(xì)胞TC-1 mRNA和蛋白均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表4。

圖6 miR-19-3p靶向、調(diào)控TC-1

表4 miR-19-3p調(diào)控TC-1 mRNA、蛋白的表達(dá)

2.6過表達(dá)TC-1表達(dá)能逆轉(zhuǎn)miR-19-3p過表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27細(xì)胞中TC-1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)均顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著升高，24、48、72 h細(xì)胞活性均顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著下降(均P<0.05)；與miR-19-3p +pcDNA3.1組相比，miR-19-3p +pcDNA3.1-TC-1組CAL27細(xì)胞TC-1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)均顯著上升，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著下降，24、48、72 h細(xì)胞活性均顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著下降，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著上升(P<0.05)。見圖7、表5。

圖7 TC-1及凋亡、遷移蛋白的表達(dá)

表5 各組凋亡、侵襲蛋白表達(dá)及細(xì)胞活性、凋亡率、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)比較

3 討 論

miRNA是一類單鏈內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用〔6〕。miR-17-92簇是第一個被鑒定的致癌miRNA，也稱為oncomir-1，其基因組擴(kuò)增和高表達(dá)在各種類型的癌癥中均有發(fā)現(xiàn)，而miR-19是miR-17-92簇的關(guān)鍵成員，對促進(jìn)腫瘤發(fā)生具有重要作用〔7～9〕。據(jù)報(bào)道，miR-19在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌等很多癌癥中均出現(xiàn)異常表達(dá)〔10，11〕。Christopher等〔12〕在研究中通過生物信息學(xué)方法篩選口腔鱗癌中與炎癥相關(guān)的miRNA發(fā)現(xiàn)，miRNA-19a/b在調(diào)控口腔鱗癌的炎癥反應(yīng)中具有顯著影響，推測miRNA-19a/b的靶基因?qū)谇击[癌診斷和靶向治療有巨大潛力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-19-3p在口腔鱗癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，這是國內(nèi)外首次明確miR-19-3p在口腔鱗癌中的異常表達(dá)，為miR-19-3p在口腔鱗癌中的研究及開發(fā)奠定基礎(chǔ)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-19-3p抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)其凋亡，這些結(jié)果均在研究miR-19-3p對口腔鱗癌的診斷和治療中的潛在價值奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)進(jìn)行miR-19-3p在其他癌癥中的功能及機(jī)制研究提供理論依據(jù)；深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-19-3p可靶向負(fù)調(diào)控TC-1的表達(dá)，這說明miR-19-3p對口腔鱗癌細(xì)胞表型的調(diào)控功能與調(diào)控TC-1有關(guān)，為miR-19-3p的調(diào)控機(jī)制研究提供依據(jù)。

TC-1是在2000年由澳大利亞學(xué)者Chua等〔13〕在研究甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)的一個新基因，后被命名為 C8orf4基因。近期，TC-1在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌中均出現(xiàn)表達(dá)異常升高〔14～17〕。白琳琳等〔18〕報(bào)道，TC-1在舌鱗癌組織中的過度表達(dá)與舌鱗癌的低分化程度相關(guān)。Zhang等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，TC-1在舌鱗癌組織中的表達(dá)明顯升高，且與晚期TNM分期顯著相關(guān)，其作用與調(diào)控Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路密切相關(guān)，提示TC-1的高表達(dá)水平可能通過增強(qiáng)Wnt信號通路的活性來促進(jìn)OTSCC的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，TC-1表達(dá)可受miR-19-3p的抑制，且過表達(dá)TC-1也可逆轉(zhuǎn)miR-19-3p的表達(dá)，這暗示TC-1在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，為TC-1在口腔鱗癌中的功能研究奠定基礎(chǔ)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TC-1還可逆轉(zhuǎn)miR-19-3p對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，這說明TC-1不僅可逆向調(diào)控miR-19-3p在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)，還可逆轉(zhuǎn)miR-19-3p對口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，為miR-19-3p在口腔鱗癌中的功能及機(jī)制研究提供依據(jù)。

綜上，miR-19-3p在口腔鱗癌中低表達(dá)，過表達(dá)miR-19-3p可抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制與靶向TC-1相關(guān)，為口腔鱗癌的靶向治療提供新靶點(diǎn)。