曾祥亮，余冬冬，黃星鋒，李永軍

(1.龍港市信實(shí)莊稼醫(yī)院，浙江 龍港 325800； 2.浙江農(nóng)藝師學(xué)院，浙江 杭州 310021)

辣椒是中國(guó)五大蔬菜作物之一，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。辣椒病毒病又稱辣椒花葉病，是辣椒的主要病害之一，春、秋兩季均有發(fā)生，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量。引起辣椒病毒病的病毒有多種，但主要為煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)?；疾±苯分饕憩F(xiàn)為花葉、黃化、矮化、壞死、畸形等癥狀，其中“三落”(落葉、落花、落果)現(xiàn)象最為嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年因病毒病危害，辣椒可減產(chǎn)30%～50%。

已有研究發(fā)現(xiàn)，種子可攜帶病毒，辣椒煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的鈍化溫度在55 ℃以上，而辣椒種子溫湯處理的耐溫閾限在55 ℃以下，常規(guī)熱處理無(wú)法鈍化上述2種病毒。常規(guī)種子消毒法、化學(xué)處理法對(duì)辣椒煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的處理效果較差。

本試驗(yàn)采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理，旨在研究辣椒種子脫毒的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)辣椒品種為大果早豐。

1.2 方法

挑選粒大飽滿的早豐1號(hào)辣椒種子浸泡6～8 h，用自來(lái)水沖洗1～2 h，75%的酒精處理2 min，無(wú)菌水沖洗2～3次，0.1%氯化汞消毒5～7 min，再用無(wú)菌水沖洗5～6次，播于1/2 MS無(wú)激素固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為光照∶黑暗14 h∶10 h，光照強(qiáng)度2 000 lux，白天溫度(26±1)℃，夜晚溫度(23±1)℃，待無(wú)菌苗出現(xiàn)2片以上真葉時(shí)，用汁液摩擦接種進(jìn)行指示法病毒檢測(cè)，無(wú)菌水處理的作為對(duì)照。

以MS為基本培養(yǎng)基，加入3%的蔗糖，0.7%的瓊脂，pH 5.8～6.0，并在培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，建立適宜辣椒生長(zhǎng)的離體培養(yǎng)技術(shù)體系[1]。取病毒檢測(cè)為陽(yáng)性的試材，待無(wú)菌苗有2～3片真葉時(shí)，切取其上端接種在上述培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，分別采用辣椒的子葉、胚軸、真葉接種在上述培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)再生培養(yǎng)[2]。

經(jīng)初代培養(yǎng)后，根據(jù)分化程度配不同的繼代培養(yǎng)基以促莖、葉和根的生長(zhǎng)或愈傷組織分化成苗。將培養(yǎng)獲得的辣椒試管苗移栽到盛有消毒營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，上扣小燒杯，溫室內(nèi)培植數(shù)日后，移栽防蟲(chóng)網(wǎng)室,采用植物指示檢測(cè)脫毒效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒繼代培養(yǎng)影響因素

以辣椒無(wú)毒苗切段(每節(jié)至少1個(gè)腋芽)為外殖體進(jìn)行快速繁殖，找出適宜辣椒繼代增殖的激素組分和培養(yǎng)條件。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在其中分別添加吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、奈乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA)等不同生長(zhǎng)激素。

如表1所示，培養(yǎng)基中僅加生長(zhǎng)素IAA、NAA，或添加高濃度的IAA，低濃度BA，易形成愈傷組織，但不能分化成苗，說(shuō)明生長(zhǎng)素在適宜濃度區(qū)間可以促進(jìn)組織分化，但濃度過(guò)大時(shí)便會(huì)抑制根的發(fā)生。高濃度BA與低濃度IAA有利于誘導(dǎo)出芽，但伸長(zhǎng)較慢，且生根也很慢，需將伸長(zhǎng)的苗轉(zhuǎn)到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

表1 培養(yǎng)基中添加NAA、IAA、BA對(duì)辣椒切斷培養(yǎng)的影響

如表2所示，IBA濃度越高，越容易形成愈傷組織，同時(shí)也促進(jìn)生根，GA的濃度越高，有利于促進(jìn)芽的萌發(fā)。培養(yǎng)基中加入0.25 mg·L-1GA和0.1 mg·L-1IBA后，較適合辣椒的繼代增殖，可一次成苗，成苗率高。

表2 培養(yǎng)基中添加GA、IBA對(duì)辣椒切斷培養(yǎng)的影響

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)辣椒子葉離體培養(yǎng)的影響

如表3所示，6-BA/IBA在11.25～12.5時(shí)器官分化率較高，6-BA/IBA在11.7～15時(shí)器官分化率較低。

表3 不同6-BA、IBA濃度對(duì)辣椒子葉器官分化的影響

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)辣椒胚軸離體培養(yǎng)的影響

采用大果早豐辣椒品種的下胚軸，分別離體培養(yǎng)在附加不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，研究其對(duì)辣椒胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)及再生情況[3]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加5 mg·L-16-BA和0.8 mg·L-1IBA后，培養(yǎng)基對(duì)芽的誘導(dǎo)率較高(表4)。

表4 不同6-BA、IBA濃度對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

2.4 熱處理溫度對(duì)脫毒效果的影響

如表5所示，隨著處理溫度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理植株的成活率逐步降低。當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，植株均不能長(zhǎng)時(shí)間存活；當(dāng)溫度低于38 ℃時(shí)，植株均能較好生長(zhǎng)。在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，病毒的鈍化效果越好。在不影響辣椒存活的前提下，隨著熱處理溫度的升高，植株的脫毒效果也就越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，38 ℃的熱處理4～6周時(shí)，辣椒脫毒效果最佳。

表5 不同處理溫度對(duì)植株成活率的影響

3 討論

由于辣椒外植體中不具有足夠的內(nèi)源激素，只有附加不同濃度的激素，才能促進(jìn)辣椒外植體芽分化和芽伸長(zhǎng)[4]。培養(yǎng)基中添加的激素種類、不同激素配比及其他生長(zhǎng)因子對(duì)辣椒外植體分化和再生芽伸長(zhǎng)影響較大。已有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加4～6 mg·L-16-BA對(duì)辣椒外植體芽誘導(dǎo)效果最好[5]。本研究結(jié)果表明，較高的6-BA與IBA比值有利于不定芽的誘導(dǎo)和分化。影響辣椒再生植株的關(guān)鍵問(wèn)題是分化的芽不能進(jìn)一步伸長(zhǎng)，大多只能見(jiàn)到一團(tuán)葉片，由于選材及其他原因的影響，多數(shù)試驗(yàn)中植株再生頻率低，不定芽生長(zhǎng)能力差，有的甚至停留在芽誘導(dǎo)階段，不能進(jìn)一步生長(zhǎng)，這主要與外植體的不同生理狀態(tài)及培養(yǎng)基成分有關(guān)。隨著處理溫度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理植株的成活率逐步降低。38 ℃的熱處理4～6周時(shí)，辣椒脫毒效果最佳。