于鐵妹

(深圳瑞德林生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518000)

酰胺鍵在自然界分子中是非常常見(jiàn)的化學(xué)鍵，蛋白質(zhì)作為酰胺鍵的代表性物質(zhì)，在生物體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用，比如酶催化、信號(hào)傳遞和結(jié)構(gòu)組成。此外，肽類(lèi)具有許多重要的生物活性，如抗菌活性和信息素活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上都有廣泛的應(yīng)用。

肽的分類(lèi)較為復(fù)雜，目前尚無(wú)較為一致的分類(lèi)方法，根據(jù)肽鏈長(zhǎng)度可分為二肽、三肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)。一般說(shuō)來(lái)，肽鏈上氨基酸數(shù)目在10個(gè)以?xún)?nèi)的叫寡肽，10～50個(gè)的叫多肽，50個(gè)以上的叫蛋白質(zhì)。人們習(xí)慣上也把寡肽中的二、三肽稱(chēng)為小肽。由于構(gòu)成肽的氨基酸種類(lèi)、數(shù)目與排列順序的不同，決定了肽紛繁復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能。

傳統(tǒng)的肽類(lèi)合成方法是化學(xué)法?；瘜W(xué)合成反應(yīng)高度取決于肽鏈序列，隨著肽鏈的復(fù)雜性增加，方法開(kāi)發(fā)和分析變得至關(guān)重要。盡管化學(xué)法合成多肽取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是在長(zhǎng)肽鏈、蛋白質(zhì)合成上仍然是化學(xué)領(lǐng)域的巨大挑戰(zhàn)。隨著基因工程、酶定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，逐漸開(kāi)發(fā)出化學(xué)酶法及酶法。本文將分別介紹這幾種肽類(lèi)合成方法并進(jìn)行比較。

1 化學(xué)法

目前，化學(xué)法合成肽類(lèi)仍然是生產(chǎn)治療性肽的首選方法，因?yàn)樗梢院铣蓭缀跞魏蜗胍碾男蛄校ǚ堑鞍装被犭?。一般?lái)說(shuō)，化學(xué)多肽合成包括保護(hù)、激活、縮合和去保護(hù)幾個(gè)主要步驟。目前市場(chǎng)上肽類(lèi)產(chǎn)品是由從2～50個(gè)氨基酸組成。隨著肽鏈復(fù)雜性的增加，化學(xué)合成方法的開(kāi)發(fā)和分析變得至關(guān)重要?；瘜W(xué)合成路線中主要問(wèn)題包括片段的低溶解性和消旋問(wèn)題。隨著肽鏈長(zhǎng)度的增加，雜質(zhì)的種類(lèi)和含量增加，雜質(zhì)與最終產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)很相似，將大幅增加純化難度導(dǎo)致最終產(chǎn)品成本的增加。傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法包括液相合成(SPS)和固相合成(SPPS)，新型化學(xué)合成方法有自然化學(xué)連接法(Native chemical ligation，NCL)。

1.1 液相合成

液相合成(SPS)是第一個(gè)發(fā)展起來(lái)的肽合成方法，它既包括逐步偶聯(lián)反應(yīng)，也包括肽段偶聯(lián)反應(yīng)。液相合成有多種偶聯(lián)的方法，最常用的肽段偶聯(lián)方法是羰化二亞胺法[1]。耦合劑DCC用于活化N端保護(hù)的氨基酸羧酸基團(tuán)，在親核試劑的進(jìn)攻下形成酰胺鍵。加入偶聯(lián)劑，如1-羥基苯并三唑(HOBt)，可防止外消旋，提高效率。液相多肽合成是一種可規(guī)?；a(chǎn)的方法，主要應(yīng)用于小肽(<10個(gè)氨基酸)的合成。缺點(diǎn)是氨基酸需要保護(hù)，每一步反應(yīng)后都需要分離和純化中間體。因此，液相合成大于 10個(gè)氨基酸的長(zhǎng)肽，合成步驟繁瑣、耗時(shí)、高成本。另外一個(gè)問(wèn)題是C端氨基酸在溶液中易消旋，因此首選的偶聯(lián)位置是Gly-Xxx或Pro-Xxx。此外，隨著肽尺寸的增加，片段的溶解度將成為偶聯(lián)的主要問(wèn)題[2]。

1.2 固相合成

固相肽合成(SPPS)是由Merrifield于1963年發(fā)明。SPPS可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化肽合成，徹底改變了整個(gè)化學(xué)肽合成領(lǐng)域。目前，SPPS是合成中小型多肽(<50個(gè)氨基酸)的首選方法，多種藥物肽的合成均采用SPPS方法。SPPS是將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的形式與一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸脫去保護(hù)基后作為氨基供體與過(guò)量的另一活化羧基組成形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)延伸肽鏈。SPPS的主要步驟包括縮合洗滌去保護(hù)中和及洗滌下一輪縮合操作，直到實(shí)現(xiàn)所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得多肽成品，如圖1所示。其中α-氨基用Boc(叔丁氧羰基)保護(hù)的稱(chēng)為Boc固相合成法。α-氨基用Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)的稱(chēng)為Fmoc固相合成法。Fmoc固相合成法是目前工業(yè)應(yīng)用普遍采用的方法。

圖1 固相合成(SPPS)多肽原理示意圖

SPPS的缺點(diǎn)是每一次循環(huán)反應(yīng)均需要大量的試劑，產(chǎn)生大量的廢液(每生成1 kg多肽藥物需要1000 L溶劑)[1]。后期需要昂貴的制備色譜去除具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，進(jìn)一步增加了生產(chǎn)成本。SPPS的上述缺點(diǎn)也限制了其在多肽合成中的生產(chǎn)規(guī)模。此外，超過(guò)10個(gè)氨基酸的肽往往形成三級(jí)結(jié)構(gòu)，使進(jìn)一步的合成困難。因此，SPPS的工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模受到一定的限制。

1.3 NCL法(Native chemical ligation)

NCL是一個(gè)相對(duì)較新的化學(xué)合成方法，能夠在緩沖液中將未保護(hù)的肽片段縮合形成新的肽鏈。NCL法是將硫酯形式的?；w肽段與親核氨基供體通過(guò)兩步反應(yīng)進(jìn)行縮合。第一步是可逆的硫與硫酯的交換反應(yīng)，第二步是將S->N ?；D(zhuǎn)移至新縮合的肽鏈上形成酰胺鍵，該反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行且不可逆，如圖2所示。NCL法已被成功用于200個(gè)氨基酸以上的蛋白質(zhì)合成[3]。在縮合位置需要半胱氨酸參與反應(yīng)是限制NCL法應(yīng)用的主要原因。另外，需要昂貴的硫酯形式的?；w也限制了NCL法的工業(yè)化應(yīng)用。

圖2 NCL法合成多肽原理圖

2 化學(xué)酶法合成多肽

將化學(xué)法與酶法結(jié)合用于肽類(lèi)的合成方法稱(chēng)為化學(xué)酶法，用于化學(xué)酶法合成肽類(lèi)的酶主要是蛋白酶。利用蛋白酶與化學(xué)法結(jié)合合成肽類(lèi)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)過(guò)程氨基酸無(wú)需側(cè)鏈保護(hù)，反應(yīng)條件溫和可防止外消旋化，并且可以引入所需的區(qū)域選擇性、立體選擇性和底物選擇性。

蛋白酶在生物體類(lèi)主要催化蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)。隨著非水相技術(shù)的發(fā)展，蛋白酶被證明在非水相反應(yīng)體系中仍可催化反應(yīng)并表現(xiàn)出很多特有的性能。本文將主要介紹用于多肽合成的蛋白酶sortase，butelase，subtiligase，peptiligase和omniligase。

sortase A來(lái)源于Staphylococcus aureus，廣泛應(yīng)用于肽和蛋白質(zhì)的后修飾。Sortase A專(zhuān)一性識(shí)別C端為L(zhǎng)PXTG(X為任意氨基酸)的序列，可將LPXTG中Thr與Gly之間的酰胺鍵斷裂再與另一個(gè)帶甘氨酸的肽鏈N端相連，實(shí)現(xiàn)肽、蛋白質(zhì)的修飾和肽的合成。Sortase A 具有催化活力低，酶用量大，底物特異性強(qiáng)，同時(shí)水解副反應(yīng)的存在導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率不超過(guò)50%等缺點(diǎn)。Butelase的發(fā)現(xiàn)克服了部分Sortase A的缺點(diǎn)，Butelase專(zhuān)一性識(shí)別C端Asx-His-Val的序列，可將AsX與His之間的酰胺鍵斷裂再與另一任意氨基酸(Xaa)肽鏈的N端相連，實(shí)現(xiàn)肽的連接。Butelase的催化效率極高，僅需少量的酶在短時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)。Butelase1催化GFP與人生長(zhǎng)激素(somatropin)環(huán)化反應(yīng)在15 min完成，轉(zhuǎn)化率95%[4]。盡管如此，Sortase A與butelase在肽鏈合成中仍具有明顯的局限性：(1)明顯的水解副反應(yīng)，導(dǎo)致合成轉(zhuǎn)化率較低，需到大量底物。(2)酶的底物專(zhuān)一性強(qiáng)，僅能識(shí)別催化特定的序列。(3)酶本身的不穩(wěn)定性。因此針對(duì)蛋白酶法合成肽類(lèi)的缺點(diǎn)，科學(xué)家們一直在探索改良方法，通過(guò)對(duì)蛋白酶的定向進(jìn)化，不斷提高蛋白酶的性能。Peptiligase是一種枯草芽孢桿菌蛋白酶的突變體。Peptiligase無(wú)需Ca2+離子，催化C端為carboxamidomethyl(Cam)-ester 的片段與氨基供體縮合成新肽鏈，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%。同時(shí)，Peptiligase 熱穩(wěn)定性好(Tm=66 ℃)，可耐受一定濃度的有機(jī)溶劑(如50% DMF)和復(fù)性劑(2M 尿素或鹽酸胍)。Peptiligase 對(duì)氨基供體片段具有很強(qiáng)的特異性，偏向于催化N端為Gly、Ala和Ser的氨基供體片段。Toplak 團(tuán)隊(duì)在peptiligase的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)多輪定點(diǎn)突變，獲得新突變體命名為Omniligase。Omniligase明顯擴(kuò)大了可催化的氨基供體范圍。Omniligase不僅可用于化學(xué)酶法合成肽類(lèi)，還可用于線性肽鏈的環(huán)化[5]。Nuijens[6]通過(guò)化學(xué)-蛋白酶法成功合成了克級(jí)規(guī)模的艾塞那肽。然而，在工業(yè)應(yīng)用方面化學(xué)酶法還處于起步階段。由于催化劑的性能在很大程度上決定了工業(yè)應(yīng)用的可行性，因此酶的發(fā)現(xiàn)和改造仍是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

3 酶法合成肽類(lèi)

ATP依賴(lài)型羧酸鹽-胺連接酶可利用活化的羧酸形成乙酰磷酸中間體，催化羧酸(R3C-COOH)和(R3C-NH2)氨基供體縮合形成酰胺鍵。最早發(fā)現(xiàn)的形成酰胺鍵的ATP依賴(lài)型酶為生物素脫羧酶(EC6.3.4.14)，D-Ala-D-Ala連接酶(EC6.3.2.4)，谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)。其中D-Ala-D-Ala連接酶可利用D型氨基酸合成同型二肽(homodipeptide)，谷胱甘肽合成酶已大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)谷胱甘肽。除以上酶之外能合成二肽和寡肽的還有L-氨基酸連接酶(LAL)。

LAL屬于ATP依賴(lài)型連接酶超家族，該酶可以利用未保護(hù)的氨基酸合成二肽及寡肽。第一個(gè)報(bào)道的Lal來(lái)源于Bacillus subtilis 168，由ywfE基因編碼，負(fù)責(zé)催化L-丙氨酸和抗莢膜菌素形成抗生素芽孢桿菌溶素(bacilysin)。研究表明，YwfE 催化氨基酸底物合成二肽，二肽的N端偏好結(jié)構(gòu)小的氨基酸如丙氨酸、絲氨酸和甘氨酸。C端偏好大、中性的氨基酸如苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸。很多不同來(lái)源的LAL相繼被報(bào)道，如RizA，Rsp1486a，BL00235，PSPPH 4299，plu1440，TabS，F(xiàn)tyB。LAL具有不同的底物特異性，如Tabs合成N端為較大的氨基酸，可以生成多種有用的二肽[7]如Arg-Phe(降壓作用)，Leu-Ile(抗抑郁作用)和Leu-Ser(鹽味增強(qiáng)劑)。LAL也可以用于發(fā)酵合成二肽，如以YwfE構(gòu)建的工程菌合成L-Ala-L-Gln(丙谷二肽)[8]。最近LAL被發(fā)現(xiàn)也可生成三肽及以上的寡肽，RizB可催化底物Val和Arg-Ser合成三肽Val-Arg-Ser[9]，Spr0969、BAD1200可合成更長(zhǎng)的肽鏈。目前為止，還沒(méi)有寡肽合成能力的LAL的晶體結(jié)構(gòu)分析，對(duì)該類(lèi)酶的結(jié)構(gòu)分析更有利用于分析寡肽合成的機(jī)理。

4 肽類(lèi)合成總結(jié)

本文將目前主要的肽類(lèi)合成方法進(jìn)行了介紹，包括化學(xué)法、化學(xué)酶法和酶法?，F(xiàn)階段并無(wú)一種方法可滿足所有肽類(lèi)的合成，合成方法的選擇可根據(jù)肽的序列、長(zhǎng)度和性質(zhì)等方面進(jìn)行分析。表1對(duì)以上各種方法在規(guī)模、肽鏈長(zhǎng)度等多個(gè)角度進(jìn)行了比較分析。在多肽合成中，化學(xué)法仍然是生產(chǎn)藥物肽的首選方法，因?yàn)樗梢院铣蓭缀跞魏蜗胍碾男蛄校ǚ堑鞍踪|(zhì)氨基酸肽。化學(xué)酶法技術(shù)還處于研究初期，隨著化學(xué)酶法技術(shù)的發(fā)展，特別是基因工程、蛋白質(zhì)工程技術(shù)在新型肽類(lèi)連接酶的發(fā)掘和改造中的應(yīng)用，將會(huì)開(kāi)發(fā)出越來(lái)越多的具有特定性能的肽類(lèi)連接酶，化學(xué)酶法在肽類(lèi)合成中的應(yīng)用將展現(xiàn)出越來(lái)越明顯的優(yōu)勢(shì)。

表1 肽類(lèi)合成方法比較