姚佳明，田亞平*

（江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

抑菌肽是廣泛存在于自然界生物體中的一類小分子肽，是人或動物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。抑菌肽具有抑菌活性強、抑菌譜廣、穩(wěn)定性高、種類繁多、不產(chǎn)生抗藥性，對動物、人體的正常細胞無毒無害等優(yōu)點[2]，近年來成為動物飼料加工、食品防腐劑、生物防治、醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域研究的熱點?？咕闹饕獊碓从谖⑸?、植物、動物[3-4]，其中微生物來源的抗菌肽因資源豐富、生長周期短、代謝快等優(yōu)點，為目前研究開發(fā)的重點。

屬于生防菌株的解淀粉芽孢桿菌（B a c i l l u s amyloliquefaciens），可強烈抑制多種病原真菌，如番茄青枯病菌[5]、蘆筍莖枯病菌[6]、水稻紋枯病菌[7]，及多種細菌的生長，目前被廣泛用于飼料添加[8]、食品防腐[9]、生物防治、污水治理[10-11]等領(lǐng)域。近年來，已有許多學者對B. amyloliquefaciens發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌活性成分進行分離分析研究。Wong[12]和Arrebola[13]等分別從B. amyloliquefaciens發(fā)酵產(chǎn)物中分離出可抑制肝癌、結(jié)腸癌細胞生長的蛋白質(zhì)及具有抑制病原真菌作用的IturinA脂肽。An Junying等[14]從B. amyloliquefaciensZJHD3-06發(fā)酵產(chǎn)物中分離出分子質(zhì)量為20 kDa、對食物腐敗菌有抑制作用的細菌素CAMT2。桑建偉等[15]用聚合酶鏈式反應技術(shù)判斷B. amyloliquefaciensBEB17是否含有脂肽類和聚酮類物質(zhì)的合成基因，結(jié)合質(zhì)譜法分析，已明確證明菌株可分泌Surfactin、Fengycin和Iturin三類脂肽，及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三類聚酮類物質(zhì)。目前分離得到的抑菌肽大多具有分子質(zhì)量小、帶正電、兩性親和等特點[16]，如何高效的分離、純化微生物產(chǎn)生的具有高抑菌活性的物質(zhì)已成為研究熱點。

前期通過誘變及培養(yǎng)基配方優(yōu)化，使B. amyloliquefaciens發(fā)酵液的抑菌物質(zhì)活性大幅度提高[17]。在此基礎(chǔ)上，本實驗以B. amyloliquefaciens發(fā)酵液作為原料，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，對發(fā)酵液中抑菌活性成分進行多步分離純化，并對抑菌活性較高的成分進行鑒定及抑菌譜的表征，以期為新型抗菌肽的不斷開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

B. amyloliquefaciens、大腸桿菌（E. coli）JM 109、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）WB 600均為本實驗室保存；腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）BNCC 103134、單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）CICC 336877 北納生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖40 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCO310 g/L，pH 7； 發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖10 g/L、蛋白胨15 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、CaCO310 g/L、瓊脂20 g/L（固體培養(yǎng)基添加），pH 7；LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂20 g/L（固體培養(yǎng)基添加），pH 7。

1.1.3 試劑

流動相試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

?KTA avant蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；1525 EF半制備型反相高效液相色譜（reverse phasehigh performance liquid chromatography，RP-HPLC）系統(tǒng)、MALDI SYNAPT MS液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）系統(tǒng)美國Waters公司；CF15RN立式冷凍離心機 日本Hitachi公司；0.22 μm水相濾膜 上海弗立特實業(yè)有限公司；Enspire 2300多功能酶標儀 珀金埃爾默有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定多肽及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白為標準蛋白，測定并繪制標準曲線，測定范圍為25～2 500 μg/mL。

1.3.2 抑菌圈測定

參考石慧等[18]對放線菌抑菌活性的檢測方法，對其進行改良。無菌平板內(nèi)放置3 枚內(nèi)徑為7 mm的無菌牛津杯，取生長對數(shù)期的指示菌菌液，加入預冷至40 ℃的固體LB培養(yǎng)基中，使指示菌的終濃度為107CFU/mL，倒平板，冷卻后，取出牛津杯，每孔加入100 μL，BCA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的抑菌劑。4 ℃擴散1 h后，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測抑菌圈直徑，求平均值。

1.3.3 抑菌率測定

取100 μL BCA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的抑菌劑與100 μL菌濃度為108CFU/mL的指示菌菌懸液混合均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，用酶標儀在600 nm波長處測定吸光度。等量無菌LB液體培養(yǎng)基代替抑菌劑作對照，抑菌率計算公式如下：

式中：A1為實驗組的吸光度；A0為對照組的吸光度。

1.3.4 抑菌物質(zhì)的純化鑒定及抑菌譜表征

1.3.4.1 抑菌物質(zhì)粗提液的制備

從B. amyloliquefaciens的固體平板上挑取單菌落，接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)9 h后以接種量2%（體積分數(shù)）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，用0.22 μm無菌濾膜對上清液過濾除菌，緩慢滴加6 mol/L HCl溶液，不斷攪拌至pH 2，4 ℃過夜保存，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，棄上清液，用等量的無菌水重懸沉淀，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7。冷凍干燥后，用三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V）的多次萃取，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)有機溶劑，得到黃色晶體。測定BCA質(zhì)量濃度并檢測抑菌活性。

1.3.4.2 DEAE-Sepharose-Fast Flow陰離子交換層析

用少量甲醇溶解1.3.4.1節(jié)粗提樣品，用濾膜除菌，色譜柱：DEAE-Sepharose-Fast Flow陰離子色譜柱，流動相：A為20 mmol/L，pH 8的Tris-HCl緩沖液；B為1 mol/L NH4HCO3的Tris-HCl緩沖液；進樣量5 mL，檢測波長2 20 nm。用3 倍柱體積的流動相A洗脫后，用0%、60%、80%、100%體積分數(shù)的流動相B進行梯度洗脫，按峰收集，濃縮除鹽后測定每個收集液的蛋白濃度并檢測抑菌活性。

1.3.4.3 RP-HPLC分析

取1.3.4.2節(jié)分離得到的樣品溶于少量甲醇中，用濾膜除菌。色譜條件：Waters XBridge Prep C18色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm），流動相A：含0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的乙腈，流動相B：含0.1% TFA的超純水，流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm，進樣量0.5 mL。用流動相B平衡3 倍柱體積，選擇線性洗脫方式，按峰收集，除去有機溶劑后，測定蛋白質(zhì)量濃度并檢測抑菌活性。

1.3.4.4 LC-MS檢測

收集抑菌活性較高的分離峰，用濾膜過濾除菌。層析柱：BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相A：含0.1% TFA的乙腈，流動相B：含0.1% TFA的超純水，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，檢測波長220 nm，柱溫45 ℃，梯度洗脫程序：0～3 min，5% A、95% B；3～15 min，5%～95% A、95%～5% B；15～17 min，95%～100% A、5%～0% B；17.1 min，5% A、95% B。分離峰被注入MALDI SYNAPT MS LC-MS系統(tǒng)，采用電噴霧電離正離子模式，獲得信號峰的質(zhì)譜圖。

1.3.4.5 Surfactin與6肽的抑菌譜測定

配制BCA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Surfactin與6肽的抑菌液，選取枯草芽孢桿菌、單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌，根據(jù)1.3.2節(jié)方法，測定抑菌圈。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3 次，采用Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-Sepharose-Fast Flow陰離子交換層析分離

如圖1a所示，收集得到A、B、C、D四個峰，測定每個峰的抑菌圈直徑和抑菌率，由圖1b可知，洗脫液中NH4HCO3濃度為0.6 mol/L時，所對應的洗脫峰B檢測出抑菌圈，抑菌直徑為（19.2±0.3）mm，抑菌率為61.25%，由此判斷洗脫峰B為活性峰，對其進一步分離。

圖1 DEAE陰離子交換層析圖譜（a）及其抑菌效果（bb）Fig. 1 Separation of bioactive substances by DEAE anion ion exchange chromatography (a) and their antibacterial activity (b)

2.2 RP-HPLC層析分離

圖2 RP-HPLC層析圖譜（a）及其抑菌效果（bb）Fig. 2 RP-HPLC chromatogram of peak B as shown in Fig. 1 (a) and antibacterial activity of its components (b)

采用RP-HPLC對離子交換層析得到的活性峰進一步分離，結(jié)果如圖2a所示，收集共10 個洗脫峰，編號為A～J，測定各個峰的抑菌活性，如圖2b所示，當乙腈體積分數(shù)為30%～40%時，對應洗脫峰D的抑菌活性最高，抑菌直徑為（18.0±0.2）mm，抑菌率為57.62%；當乙腈體積分數(shù)為45%～55%時，對應洗脫峰F的抑菌活性次之，抑菌直徑（16.2±0.3）mm，其抑菌率為48.35%，其他收集峰未檢測出抑菌圈。由此得到2 種純化產(chǎn)物，對其進一步質(zhì)譜分析。

2.3 多步分離純化的抑菌活性比較

圖3 分離純化活性峰的抑菌直徑Fig. 3 Diameters of inhibition zone of S. aureus when exposed to the fermentation supernatant of B. amyloliquefaciens and antibacterial components puri fied from it

B. amyloliquefaciens菌株發(fā)酵上清液通過酸沉、有機溶劑萃取、DEAE陰離子交換層析、半制備型RP-HPLC，最終得到兩個抑菌活性較高的分離峰。抑菌劑的多肽質(zhì)量濃度都均為1 mg/mL，以純甲醇為對照，對比抑菌圈直徑，由圖3可見，抑菌活性從大到小為：酸沉有機溶劑萃?。?8.1±0.3）mm＞發(fā)酵上清液（25.4±0.2）mm＞離子交換層析峰B（19.2±0.3）mm＞RP-HPLC峰D（18.0±0.2）mm＞RP-HPLC峰F（16.2±0.3）mm。據(jù)報道B. amyloliquefaciens發(fā)酵液中含有多種抑菌成分，通過分離純化得到純度相對較高的兩種抑菌成分，與同質(zhì)量濃度的粗提成分相比，發(fā)現(xiàn)抑菌活性反而降低，分析除純化過程中部分抑菌活性可能有所損失外，推測多種抑菌成分并存時，可能還存在協(xié)同抑菌或聯(lián)合抑菌效果。

2.4 LC-MS分析

2.4.1 活性峰D的質(zhì)譜分析

利用LC-MS對活性峰D分析，由圖4可見，主要信號峰出現(xiàn)在6.57、7.09、7.40 min，對3 個信號峰進行質(zhì)譜分析，通過主要信號峰的積分面積，計算3 種脂肽同系物的純度為93.78%。如圖5所示，3 種[M+H]+的m/z分別為1 008.8、1 022.8、1 036.8的信號峰，它們的分子質(zhì)量相差14 Da，與CH2的分子質(zhì)量大小一致，說明相差一個脂肪酸鏈。分析三者的二級質(zhì)譜圖，圖5中m/z為441.2是y型碎片離子峰，可解釋為[Val-Asp-Leu-Leu/Ile+H]+；其中m/z686.3的信號最強，為y型碎片離子峰，分析該碎片為[Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu/Ile+H2O+H]+。其中[M+H]+的m/z值為1 008.8的二級質(zhì)譜中m/z1 009.5－686.3=323.2，代表b型碎片離子，解釋為[R13-Glu－H2O+H]+，同理，[M+H]+的m/z為1 022.8與1 036.8的二級質(zhì)譜中，1 023.5－686.3=337.2代表[R14-Glu－H2O+H]+，1 037.5－686.3=351.2代表[R15-Glu－H2O+H]+。與黎循航[19]、向亞平等[20]報道的Surfactin[M+H]+的m/z吻合，與Chen Yulin等[21]報道的Surfactin二級質(zhì)譜碎片符合，由此確定活性峰D主要為含有C13～C15三種脂肽Surfactin的同系物。

圖4 活性峰D的色譜圖Fig. 4 Chromatogram of bioactive peak D as shown in Fig. 2

圖5 主要信號峰的二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectra of the main signal peaks as shown in Fig. 4

2.4.2 活性峰F的質(zhì)譜分析

對活性峰F進行LC-MS分析，由圖6可見，主要信號峰出現(xiàn)在10.52 min，此峰所占的峰面積為95.46%，此信號峰對應二級質(zhì)譜圖中的母離子[M+H]+為m/z640.3。利用MassLynx V4.1軟件對二級質(zhì)譜中的特征碎片峰分析，結(jié)果如圖7所示，預測活性峰F是由6 個氨基酸組成的小肽，序列為L-V-N-P-P-T。借助ExPasy中的ProtParam軟件，在線分析該抑菌肽的分子質(zhì)量為639.75 Da，分子式為C29H49N7O9，等電點為5.52，GRAVY為0.100，脂溶性指數(shù)113.33。將此多肽在NCBI、APD數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)與APD數(shù)據(jù)庫中已報道抑菌肽的同源相似性較低，與來自鏈霉菌屬的抗菌肽，APD ID為AP02577的氨基酸序列的同源性最高，為37.5%。由此推斷，此6肽為一種新型抗菌肽。

圖6 活性峰F的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of bioactive peak F as shown in Fig. 2

圖7 活性峰F的質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of bioactive peak F as shown in Fig. 2

表1 6肽與APD數(shù)據(jù)庫中已知的抗菌肽對比Table 1 Comparison between the hexapeptide and known antibacterial peptides in the APD database

2.5 兩種純化肽的抑菌譜表征

Surfactin與該6肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有抑菌效果，如表2所示。Surfactin對金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌的抑制活性高于6肽。兩種抑菌肽對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、單核細胞性李斯特菌的抑制活性均較好。

表2 兩種純化肽的抑菌譜表征Table 2 Antibacterial spectra of the two puri fied peptides

3 結(jié)論與討論

從B. amyloliquefaciens發(fā)酵上清液出發(fā)，通過酸沉、有機溶劑萃取，DEAE陰離子交換層析，結(jié)合制備型RP-HPLC，收集到抑菌活性較高的2 個洗脫峰。對2 種純化產(chǎn)物進行LC-MS分析，由二級質(zhì)譜中的特征離子碎片，結(jié)合文獻[21-22]報道及MassLynx V4.1軟件分析，明確純化產(chǎn)物為含有C13～C15脂肪酸鏈的Surfactin同系物與氨基酸序列為L-V-N-P-P-T，分子質(zhì)量為639.75 Da的抑菌肽。將6肽的氨基酸序列與APD數(shù)據(jù)庫中已報道的抑菌肽進行同源性比較，其中同源性最高的僅為37.5%，由此推斷，此6肽為新型抗菌肽。鑒于Surfactin與6肽對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、單核細胞性李斯特菌3 種致病菌的生長均有較強的抑制作用，可將其應用于肉類、奶制品等食品防腐劑或飼料添加劑中。

Surfactin最早發(fā)現(xiàn)于芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物，屬于環(huán)脂肽類抑菌物質(zhì)。Surfactin由7 個氨基酸和含有C13～C15的脂肪酸鏈組成[23]，兼?zhèn)鋬尚晕镔|(zhì)的特點，分子質(zhì)量小，抗逆性強，具有抗腫瘤、真菌、支原體、病毒的功效[24]。近年來被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前認為，Surfactin的抑菌作用是通過使敏感細胞膜上的?；湴l(fā)生傾斜，磷脂基團重定向于細胞膜內(nèi)部[25]，導致Surfactin的肽段插入細胞膜，從而有效破壞細胞膜滲透性及完整性[26-27]。

純化得到的6肽疏水性較強，具有分子質(zhì)量小、合成簡單的優(yōu)點。結(jié)合疏水性較強的肽類可在體外與敏感細菌的DNA結(jié)合的報道[28]，推測該6肽穿過細胞膜后，可與細菌DNA雙螺旋內(nèi)部的疏水區(qū)結(jié)合，干擾細菌DNA的轉(zhuǎn)錄、復制、翻譯，影響細胞正常分裂。

在分離過程中發(fā)現(xiàn)菌株代謝產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，隨著單一抑菌成分純度提高，發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)的活性提升并不顯著。目前，已發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂與乳酸菌素Nisin可協(xié)同抑制李斯特菌[29]，ε-葡萄素與萬古霉素可協(xié)同抑制金黃色葡萄球菌[30-31]。由此推測，B. amyloliquefaciens發(fā)酵液中多種抑菌物質(zhì)之間可能也存在協(xié)同或者聯(lián)合抑菌作用。新型抑菌肽的抑菌機理及可能的協(xié)同或聯(lián)合抑菌作用有待進一步的研究。