董仁超，劉邦國

牙周炎是發(fā)病率高、危害性大、累及牙周支持組織的炎癥性、破壞性疾病，若得不到及時(shí)有效治療，不僅造成牙齒牙周的局部損害，還會(huì)引起或加重心腦血管疾病、糖尿病、肝炎、腎炎等身體其他重要器官和組織的病變。相比于口服抗生素全身性用藥，牙周袋局部給予緩釋藥物治療效果較好［1-5］，但是這類制劑多為國外制品，國內(nèi)雖有但是效果差，筆者以不易產(chǎn)生耐藥性且抗菌譜廣的醋酸氯己定作為模型藥物，研制原位凝膠緩釋制劑處方優(yōu)選，該制劑經(jīng)兔牙周袋上緣無痛注入牙周袋，遇牙齦液會(huì)凝固形成凝膠態(tài)藥物儲(chǔ)庫，在牙周袋內(nèi)長時(shí)間緩慢釋放藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該處方為理想的優(yōu)選處方，報(bào)告如下。

1 材料與儀器

N-甲基吡咯烷酮（NMP，上海埃比化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20131023）；醋酸氯己定（麥克林試劑有限公司，CAS 號(hào)：56-95-1）；單油酸甘油酯（GMO，濟(jì)南東潤精化科技有限公司）；乙基纖維素（EC，N100，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；醋酸氯己定原位凝膠（自制）；空白原位凝膠（自制）；蒸餾水（解放軍第971醫(yī)院藥劑科自制）。

紫外分光光度計(jì)（UV-757型，上海精密科學(xué)有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；電子分析天平（FA1604型，上海衡平儀器儀表廠）；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（WHY-2型，常州普天儀器制造有限公司）；超聲清洗儀（SY2200-T型，上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）；離心機(jī)（LD5-2A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1原位凝膠體外釋放度測(cè)定方法的建立

2.1.1 供試液的制備 取醋酸氯己定原位凝膠50 mg，精密稱定，注入EP管中，加入4 ml釋放介質(zhì)（蒸餾水），密閉，放入水浴恒溫振蕩器（37℃，振蕩頻率 55 次/min）中，分別于 4 h、8 h、10 h、12 h 將 EP管中釋放液取出，同時(shí)補(bǔ)加相應(yīng)量的釋放介質(zhì)，放回水浴恒溫振蕩器中。將取出的釋放介質(zhì)以蒸餾水稀釋至適當(dāng)濃度，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取醋酸氯己定對(duì)照品10 mg，精密稱定，于燒杯中，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，用蒸餾水定容；精密量取2.0 ml于50 ml容量瓶中，以蒸餾水定容。

2.1.3 空白基質(zhì)對(duì)照液的制備 精密稱取不含醋酸氯己定的空白原位凝膠0.050 g，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備空白基質(zhì)對(duì)照液。

2.1.4 測(cè)定波長的選擇 在200～400 nm波長下，以紫外可見分光光度儀分別以蒸餾水為對(duì)照測(cè)定空白基質(zhì)對(duì)照液、供試液的紫外光譜圖。結(jié)果分別見圖 1、2。

圖1 空白基質(zhì)對(duì)照液紫外光譜圖

圖2 供試液紫外光譜圖

由圖1、圖2可知，供試液中醋酸氯己定最大吸收波長為260 nm，空白基質(zhì)對(duì)照液在260 nm處無吸收，故以釋放介質(zhì)蒸餾水為空白對(duì)照測(cè)定釋放液中醋酸氯己定含量。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取10 mg醋酸氯己定對(duì)照品，精密稱定，于燒杯中，加入適量蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中，用蒸餾水定容。分別移取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 ml于 50 ml容量瓶中， 加水定容， 配成濃度為3.2、4.0、4.8、5.6、6.4、7.2、8.0 μg/ml的溶液，在374.5 nm處測(cè)定其吸光度A。以濃度C（μg/ml）對(duì)吸收度A進(jìn)行線性回歸?；貧w方程：A=0.0818C+0.0096，r=0.9999。故醋酸氯己定在 3.2～8.0 μg/ml濃度范圍符合Beer定律，吸收度與濃度呈良好的線性關(guān)系。見表1、圖3。

圖3 醋酸氯己定對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在374.5 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD=0.19%（n=5），表明精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.5”項(xiàng)下供試液，測(cè)定其中醋酸氯己定含量，以第一次測(cè)量值為0時(shí)值，每隔2 h依次測(cè)定。由表2可知供試液中醋酸氯己定在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 制備不含藥的空白原位凝膠，照“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行釋放度試驗(yàn)，獲得12 h釋放液即為空白基質(zhì)對(duì)照液。分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下醋酸氯己定對(duì)照品溶液，3份不同量，于量瓶中，加入空白基質(zhì)對(duì)照液稀釋并定容至刻度，過濾，棄去初濾液，留存續(xù)濾液。分別精密量取續(xù)濾液適量于量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度，測(cè)定吸收度，計(jì)算回收率分別為101.2%、100.8%、99.6%；RSD（n=5）分別為 1.7%、0.85%、0.63%；回收率平均值為100.5%。方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.9 釋放度測(cè)定 按“2.1.1及2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行釋放度測(cè)定并制備供試液，測(cè)定供試液中藥物濃度，計(jì)算釋放度。

2.2原位凝膠的制備取乙基纖維素、N-甲基吡咯烷酮、單油酸甘油酯適量，加熱使乙基纖維素溶解，冷卻至室溫后緩緩加入醋酸氯己定粉末，邊加邊攪拌，待攪拌均勻后加熱使其溶解即得。

2.3原位凝膠處方單因素考察

2.3.1 乙基纖維素對(duì)體外釋放的影響 將處方中單油酸甘油酯、藥物的濃度固定為0.2%、5%，設(shè)定乙基纖維素的系列濃度為19%、20%、21%。按照原位凝膠的制備方法，制備3批樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法考察所制凝膠的體外釋放情況。由圖4可知，乙基纖維素的濃度越高，原位凝膠中藥物釋放的越慢，反之，釋放的越快。

圖4見封三。

2.3.2 單油酸甘油酯對(duì)體外釋放的影響 將處方中乙基纖維素、藥物的濃度固定為20%、5%，設(shè)定單油酸甘油酯的系列濃度為0.2%、0.3%、0.4%。按照原位凝膠的制備方法，制備3批樣品，考察所制凝膠的體外釋放情況。由圖5可知，單油酸甘油酯濃度增大能延長原位凝膠中藥物釋放時(shí)間，反之，單油酸甘油酯濃度減小能縮短原位凝膠中藥物釋放時(shí)間。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5見封三。

2.3.3 藥物濃度對(duì)體外釋放的影響 將處方中乙基纖維素、單油酸甘油酯劑的濃度固定為20%、0.2%，設(shè)定藥物的系列濃度為4%、5%、6%。按照原位凝膠的制備方法，制備3批樣品，考察所制凝膠的體外釋放情況。由圖6可知，藥物的濃度越低，原位凝膠中藥物釋放的越快，反之，釋放的越慢。

圖6見封三。

圖4 乙基纖維素的濃度對(duì)體外釋放的影響

圖5 單油酸甘油脂濃度對(duì)體外釋放的影響

圖6 藥物的濃度對(duì)體外釋放的影響

圖7 3批最優(yōu)處方原位凝膠的累積釋放度

2.4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選處方通過單一因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙基纖維素的（A）、單油酸甘油酯（B）、藥物（C）為考察因素，設(shè)定因素水平表（表3）。

表3 正交試驗(yàn)因素-水平表

以醋酸氯己定原位緩釋凝膠累積釋放時(shí)間為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 見表4。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

由直觀分析結(jié)果可知，各因素下各水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分別為 A=0.407、B=0.687、C=1.160，由極差大小可知C因素的極差最大，其余次之，故各因素對(duì)考察指標(biāo)影響大小次序?yàn)镃＞B＞A；另外通過比較各因素下各水平的指標(biāo)總和可知：A、B、C的第三水平均較好，從而得出各因素的最優(yōu)水平組合：A3B3C3即單油酸甘油酯0.4%，乙基纖維素 21%，藥物 6%。以 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果上述3因素的P值均＜0.05，表明A、B、C三因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有顯著性影響。

2.5處方與工藝的重復(fù)性考察按照最優(yōu)處方和“2.2.1”項(xiàng)下的制備方法，制備三批醋酸氯己定原位凝膠，按照“2.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定其釋放度和累積釋放率，對(duì)處方和工藝的重現(xiàn)性進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果見表 5，圖 7。

表5 3批最優(yōu)處方原位凝膠的累積釋藥率（n=3）

圖7見封三。

由圖7可知，醋酸氯己定原位凝膠的處方和工藝的重現(xiàn)性良好。

3 討論

注射用原位凝膠用于治療牙周炎的優(yōu)勢(shì)在于其具有較好的流動(dòng)性，可以通過特制的注射器直接注射于牙周袋內(nèi)，且具有較好的粘附性，直接以不規(guī)則的固態(tài)形式粘附于牙周袋內(nèi)，增加了患者的順應(yīng)性。

該實(shí)驗(yàn)在制備醋酸氯己定原位凝膠時(shí)有兩種不同的方法加速溶解：一種是先用高溫使乙基纖維素、單油酸甘油酯和NMP溶解再降溫并加入藥物使其溶解；第二種是用處方中一部分NMP溶解乙基纖維素和單油酸甘油酯，同時(shí)另一部分溶解藥物，再將兩者混合。從時(shí)間角度來看后者制備效率較高，但是制備的樣品數(shù)量過少時(shí)宜采用第一種方法，以避免以第二種方法制備時(shí)中間品轉(zhuǎn)移帶來的損失和誤差。

在進(jìn)行原位凝膠體外釋放度考察時(shí)，盡可能使不同樣品注入釋放液后形成的原位凝膠的形狀保持一致，以防止原位凝膠形狀及與釋放液的接觸面積不同引起釋放度的差異，準(zhǔn)確考察出選定因素對(duì)釋放度的影響。

釋放度是緩控釋制劑的重要質(zhì)量指標(biāo)，決定著給藥間隔和給藥時(shí)間。原位凝膠注入兔牙周袋后，其中的有機(jī)溶劑NMP流出，牙齦液進(jìn)入凝膠體，聚合物遇水沉淀形成固態(tài)藥物儲(chǔ)庫，其中的藥物緩慢釋放出來。有機(jī)溶劑NMP流出的同時(shí)帶出一部分藥物-突釋部分。

從上述原位凝膠的形成過程看，影響藥物釋放的因素有，有機(jī)溶劑的組成和性質(zhì)、有機(jī)溶劑與輔料和藥物的相互作用、輔料的性質(zhì)、形成的原位凝膠的孔隙率、微孔的彎曲程度等微觀結(jié)構(gòu)。通過控制上述因素就能控制制劑的釋放度，從而得到理想的原位凝膠制劑。該實(shí)驗(yàn)只對(duì)上述部分因素進(jìn)行了考察，包含釋放機(jī)制的研究有待下一步進(jìn)行。