付 潔,朱曉音,趙昕昱,田付港,于 昕

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)為第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1].近50年來,左旋多巴(Levodopa,L-DOPA)補(bǔ)充多巴胺(Dopamine,DA)缺乏仍是緩解PD運(yùn)動(dòng)癥狀的主要措施[2],但在研究及臨床使用中發(fā)現(xiàn),在服用L-DOPA的后期,由于其較短的半衰期而形成的脈沖式DA能刺激,導(dǎo)致PD患者晚期出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥[3]. 基于此,OLANOW等提出通過改進(jìn)多巴胺能藥物的給藥方式或給予長(zhǎng)半衰期的多巴胺能藥物來提供持續(xù)性的多巴胺受體刺激(continuous dopaminergic stimulation, CDS)[4].研究發(fā)現(xiàn),CDS和平穩(wěn)的血藥濃度可預(yù)防和減少運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥和晨僵現(xiàn)象[5-6]. 因此,提供和/或恢復(fù)CDS已經(jīng)成為治療PD的重要研究目標(biāo).

羅替戈汀是一種非麥角類多巴胺受體激動(dòng)劑,臨床試驗(yàn)結(jié)果表明其具有抗PD的活性[7]. 山東綠葉制藥有限公司研制的注射用羅替戈汀緩釋微球(Rotigotine Extended-release Microspheres for Injection,RoMS)是以乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)為輔料制成的長(zhǎng)效緩釋微球,一次肌肉注射(intramuscular,i.m.)給藥可持續(xù)平穩(wěn)釋藥7 d[8],從而對(duì)多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生持續(xù)性的生理刺激.

基于以上研究,本實(shí)驗(yàn)采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)小鼠PD模型,以RoMS為實(shí)驗(yàn)用藥,探討CDS給藥方式對(duì)神經(jīng)元損傷的延緩作用[9-10].

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄 性 SPF 級(jí) C57BL/6 小 鼠 (80 只, 6～8 周齡, 質(zhì)量 18～20 g,華阜康生物科技公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004).小鼠飼養(yǎng)在山東綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障飼養(yǎng)環(huán)境,室溫保持20～26 ℃,墊料每周更換1次,自由飲水和自由采食,12 h 光照,12 h 黑暗.

1.2 藥品與試劑

MPTP(批號(hào):SLBS6630)(Sigma);GTVision TMIII型免疫組化檢測(cè)試劑盒(含DAB)(上?；蚩萍脊煞萦邢薰?;Actin抗體(小鼠單抗)、GAPDH抗體(小鼠單抗)、NF-κB抗體、nNOS抗體、COX-2抗體、Cyt-C抗體(CST);BCA濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、酶標(biāo)山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(碧云天生物技術(shù)公司).

1.3 儀器

酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司);小鼠轉(zhuǎn)棒測(cè)試儀(Panlab 公司);SuperTst高通量懸尾實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)、SuperFst強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司);OLYMPUS IX73倒置熒光顯微鏡(北京奧林巴斯有限公司);冰凍切片機(jī)(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);Vectra3定量病理成像分析系統(tǒng)(上海珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MPTP誘導(dǎo)小鼠PD 模型的建立及分組

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的劑量和方法,結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,除對(duì)照組以外的小鼠連續(xù)腹腔注射(intraperitoneal, ip)MPTP(25 mg/kg) 7 d. 對(duì)照組小鼠給予等體積的羧甲基纖維素鈉(1% CMC-Na). 篩選完造模成功的小鼠后進(jìn)行為期14 d的給藥,每組14只.

PD模型的建立、具體分組與給藥見圖1.

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)前一周對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練,在第一次給藥后第5、7、12、14天進(jìn)行行為學(xué)轉(zhuǎn)棒、懸尾及強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)間隔20 min以上.

2.2.2 Western blot 方法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)nNOS,Cyt-C蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)取3只小鼠,用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注,取腦,采用BCA法提取小鼠黑質(zhì)區(qū)蛋白,以50 μg為上樣量進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),結(jié)果采用image J軟件分析,用目標(biāo)條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度值比值表示.

2.2.3 免疫組化方法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)TH表達(dá) 對(duì)各組小鼠的腦組織用梯度蔗糖(10%,20%,30%)進(jìn)行脫水固定,隨后對(duì)中腦黑質(zhì)行冠狀冰凍切片(20 μm),按照免疫組化步驟進(jìn)行染色,采用Vectra3定量病理成像分析系統(tǒng)拍攝圖片,ImagePro Plus軟件分析TH陽性神經(jīng)元數(shù)量.

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 RoMs對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠行為學(xué)的影響

如表1—3數(shù)據(jù)所示,在4個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi),模型組的轉(zhuǎn)棒、懸尾及游泳時(shí)間始終與正常組保持顯著性差異(P<0.05);另外,3個(gè)給藥組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間在不同的時(shí)間點(diǎn)始終高于模型組,表明小鼠行為能力在給藥期間得到了持續(xù)改善,其中,各給藥組的懸尾時(shí)間和游泳時(shí)間均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而在轉(zhuǎn)棒時(shí)間的觀察上,只有聯(lián)合用藥組始終具有顯著性差異(P<0.05).

在給藥結(jié)束后第14天的觀察中,L-DOPA組的療效出現(xiàn)下降趨勢(shì),運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯低于RoMS及聯(lián)合用藥組(P<0.05). 以上結(jié)果說明隨著疾病進(jìn)一步發(fā)展,L-DOPA的脈沖式刺激可能使神經(jīng)元受損嚴(yán)重,誘導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的發(fā)生,而RoMS及聯(lián)合用藥則顯示出對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用. 其中,聯(lián)合給藥組行為學(xué)改善作用表現(xiàn)更優(yōu),說明聯(lián)合用藥既可協(xié)同增效,又可以降低L-DOPA的用藥劑量,延緩或減少運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的發(fā)生.

表1 給藥期不同時(shí)間點(diǎn)小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表2 給藥期不同時(shí)間點(diǎn)小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3 給藥期不同時(shí)間點(diǎn)小鼠游泳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.2 RoMs對(duì) MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示,與模型組相比,3個(gè)給藥組nNOS和Cyt-C蛋白含量均顯著下降(P<0.01);與L-DOPA組相比,RoMS組與聯(lián)合給藥組nNOS和Cyt-C蛋白含量均下降,其中,聯(lián)合用藥組優(yōu)勢(shì)更為明顯(P<0.05),說明RoMS輔助低劑量L-DOPA給藥抗氧化應(yīng)激減輕神經(jīng)元損傷作用更強(qiáng).

3.3 RoMs對(duì) MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)量的影響

如圖3所示,與空白組相比,模型組的TH陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(P<0.01),與模型組相比,3個(gè)給藥組神經(jīng)元數(shù)目均明顯增多(P<0.01).而與L-DOPA組相比,RoMS組與聯(lián)合用藥組的陽性神經(jīng)元數(shù)目更多,說明CDS治療方式對(duì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用.進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,聯(lián)合用藥組神經(jīng)保護(hù)作用優(yōu)于RoMS組,與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合.

4 討 論

研究顯示,L-DOPA的脈沖式刺激造成的運(yùn)動(dòng)障礙給PD患者的治療帶來了很大困擾. 此外,相較于平穩(wěn)的CDS給藥,脈沖式刺激更能誘發(fā)L型谷氨酸能作用,導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]. 基于以上理論,本文在行為學(xué),組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平探討緩釋制劑RoMS對(duì)DA神經(jīng)元的保護(hù)作用.

MPTP是一種親脂性神經(jīng)毒素,可順利通過血腦屏障進(jìn)入小鼠腦中,轉(zhuǎn)化為1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+),隨后被攝入多巴胺能神經(jīng)元線粒體,導(dǎo)致線粒體膜電位的缺失、活性氧的形成以及氧化應(yīng)激狀態(tài)等,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.采用MPTP誘導(dǎo)的動(dòng)物模型,其病理變化基本與PD患者的病理變化相似,因此,被作為PD動(dòng)物模型之一.

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)可用來評(píng)價(jià)肌肉僵直以及運(yùn)動(dòng)障礙情況[12]. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在連續(xù)用藥14 d后,L-DOPA組3個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間均明顯低于RoMS及聯(lián)合用藥組,說明CDS給藥方式可能通過減輕神經(jīng)元損傷而發(fā)揮更好的癥狀改善作用. 值得一提的是,RoMS聯(lián)用低劑量L-DOPA,可產(chǎn)生協(xié)同增效的作用.

研究表明,脈沖式的DA能刺激可使L型谷氨酸大量增加,nNOS表達(dá)量增高,并產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài),使線粒體功能受損,釋放出大量的Cyt-C,損傷DA神經(jīng)元,參與包括帕金森癥在內(nèi)的幾種人類疾病的發(fā)病機(jī)制[13]. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與L-DOPA組相比,RoMS和聯(lián)合給藥組nNOS和Cyt-C蛋白含量明顯降低,說明CDS給藥具有抗氧化應(yīng)激減輕神經(jīng)元損傷作用.

TH是DA合成的限速酶,可間接反映DA神經(jīng)元的數(shù)量[13]. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RoMS組與聯(lián)合用藥組TH陽性神經(jīng)元數(shù)目比L-DOPA組更多,表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護(hù)作用.

5 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明,RoMS具有抗氧化應(yīng)激,減輕神經(jīng)元損傷,改善運(yùn)動(dòng)障礙的作用.且RoMS聯(lián)用低劑量L-DOPA,可同時(shí)發(fā)揮協(xié)同增效和神經(jīng)保護(hù)作用.