宋易洋,李桂秀,趙 芯,王國良

(1.煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005;2.北京市農(nóng)林科學院北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心,北京 100097)

南極是地球上的極端地區(qū)之一,其惡劣的生境條件孕育了特殊的土壤微生物類群[1-2]．南極地區(qū)獨特的地理位置和環(huán)境特征使大量土壤資源未被開發(fā),其中包括許多具有特殊生理生化特性和分子生物學機制的微生物資源,例如大量具有耐/嗜鹽、耐/嗜冷、抗輻射等特性的微生物[3]．

自然界中的微生物只有很小一部分可在實驗室進行分離培養(yǎng),因此土壤菌株的分離實驗結(jié)果無法描述土壤樣品中微生物的多樣性及物種之間的差異和相互作用關系[4]．近年來,隨著高通量測序技術的迅速發(fā)展,宏基因組測序成為可能[5]．應用這種免培養(yǎng)的新技術,理論上可以獲得樣本中微生物的全部DNA信息,并且可以跳過微生物分離培養(yǎng)的過程,直接在基因水平揭示微生物的多樣性與豐度,深入了解微生物的功能和相互作用,有助于進一步了解微生物群落的功能活動規(guī)律和遺傳潛力[6-7]．本研究以南極土壤為樣本,采用宏基因組測序結(jié)果分析樣本中微生物的多樣性,為后續(xù)南極土壤微生物資源的開發(fā)和保護提供技術支持．

1 材料與方法

1.1 土壤樣本采集

實驗樣本來自中國第31次南極科學考察(2014年10月30日出發(fā)),采樣區(qū)域為利奇菲爾德島,采樣時間為2015年2月3日．所有樣本低溫條件運輸至國內(nèi),實驗前在-80 ℃條件下儲藏于中國科學院北京基因組研究所．樣本相關信息見表1．

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 使用電子天平稱取3例南極土壤樣本各0.1 g,使用試劑盒(江蘇康為世紀, cw2091s)對樣本進行基因組提?。?/p>

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測 宏基因組DNA的純度和完整性檢測分別通過NanoDrop微量分光光度計和瓊脂糖凝膠水平電泳完成,DNA質(zhì)量濃度通過Qubit檢測獲得．

表1 南極土壤樣本位點信息

1.2.3 文庫構(gòu)建和高通量測序 采用二代測序技術進行高通量測序,需要對提取的宏基因組樣本進行文庫構(gòu)建．取10 ng 基因組DNA起始建庫,利用自動聚焦聲波基因組剪切儀Covaris M220將gDNA打斷成200 bp左右的片段．使用1.8×DNA 純化磁珠(Vazyme, N411)純化片段化產(chǎn)物,使用諾唯贊建庫試劑(Vazyme, ND607)進行建庫實驗．分別用全自動核酸分析系統(tǒng)Qsep100和熒光定量PCR(BioRad, CFX96)對文庫進行質(zhì)檢以確定其片段分布及質(zhì)量濃度．質(zhì)檢合格的文庫由北京貝瑞和康生物技術有限公司完成測序,測序基于Illumina NovaSeq 6000平臺,測序策略為Paired-end 150 bp．

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 測序得到的原始數(shù)據(jù)中,會帶有接頭序列或少量低質(zhì)量的序列．使用FastQC對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,生成質(zhì)檢報告．根據(jù)質(zhì)檢報告結(jié)果使用Trimmomatic[8]對數(shù)據(jù)進行過濾,以去除接頭序列等低質(zhì)量數(shù)據(jù)．然后使用MetaPhlAn2[9]進行后續(xù)分析,通過快速比對準確估計物種的相對豐度,得到微生物群落組成信息[10]．使用GraPhlAn基于分類等級繪制可視化進化樹,構(gòu)建物種群落結(jié)構(gòu)圖[11]．

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組提取結(jié)果

由圖1可見,3例宏基因組DNA樣本主帶均在10 kb以上且無明顯雜帶或降解.NanoDrop測得吸光度A260/A280(表2)均分布于1.8～2.0,說明純度符合實驗要求.基于Qubit Assay測得的DNA質(zhì)量濃度(表2)進行后續(xù)文庫構(gòu)建．

2.2 文庫構(gòu)建結(jié)果

如圖2所示,經(jīng)Qsep100檢測得到3例樣本的文庫片段分布．文庫分布于300～500 bp范圍內(nèi),峰值分別為404、411、409 bp,無引物二聚體污染,質(zhì)量符合上機要求,將文庫進行二代高通量測序．

2.3 測序與數(shù)據(jù)分析結(jié)果

下機數(shù)據(jù)詳細信息見表3．使用MetaPhlAn2對3個樣本的微生物群落組成進行分析,獲得微生物多樣性豐度匯總表(表4)和相對豐度熱圖(圖3)．由圖3可知,樣本S14、S16、S22均有明顯的黑色區(qū)域,這些黑色區(qū)域所覆蓋的細菌數(shù)量相對較大,且3個樣本均具有不同的白色區(qū)域,從整體上看,樣本間的差異性較大．群落間豐度分析顯示:3個位點的土壤樣本中既存在大量共有的土壤微生物類群,也存在一定比例的特有微生物類群．S14樣本細菌豐度占91.31%,優(yōu)勢菌屬是顆粒菌屬(Granulicella),占比為40.81%．S16樣本細菌豐度占89.56%,優(yōu)勢菌屬是羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter),占比為24.37%．與S14和S22相比,S16樣本中的特有菌屬是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)． S22樣本細菌豐度占59.84%,真菌豐度占40.16%,優(yōu)勢菌種是白色念珠菌(Candidaalbicans)．與S14和S16相比,S22樣本中的特有菌種是Rickettsiabellii．

表2 NanoDrop和Qubit檢測基因組DNA結(jié)果

表3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

表4 微生物多樣性分析結(jié)果

表4(續(xù))

使用GraPhlAn生成物種群落結(jié)構(gòu)圖(圖4),圖4中從內(nèi)而外的節(jié)點依次代表界門綱目科屬種,節(jié)點越大,豐度越高．陰影區(qū)域表示不同目下的分類,同一目中的不同區(qū)域代表不同的科屬種．圖4中包含所有樣本中相對豐度大于1%的15個目,從字母AB所屬目為始,按逆時針順序排列,分別為:酸桿菌目Acidobacteriales 、放線菌目Actinomycetales 、土壤紅桿菌目Solirubrobacterales、噬纖維菌目 Cytophagales 、鞘脂桿菌目Sphingobacteriales、酵母目Saccharomycetales、Viruses noname、根瘤菌目Rhizobiales、柄桿菌目Caulobacterales 、立克次氏體目Rickettsiales、伯克氏菌目Burkholderiales、亞硝化單胞菌目Nitrosomonadales、腸桿菌目Enterobacteriales、假單胞菌目Pseudomonadales、黃單胞菌目Xanthomonadales．由圖4可知,不同物種的豐度差異較大,酸桿菌目Acidobacteriales的物種豐度最高．

3 討 論

采用高通量測序技術對南極3個不同位點的土壤微生物多樣性進行分析,結(jié)果表明3個樣本間的微生物種群豐度差異較大,優(yōu)勢菌屬和特殊菌屬各有不同．S14樣本的優(yōu)勢菌屬是顆粒菌屬(Granulicella),Granulicella在贛南臍橙黃龍病植株和健康植株中都是優(yōu)勢菌屬,并且是不可培養(yǎng)菌屬[12]．S16樣本的優(yōu)勢菌屬是羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter),在低pH的條件下,Rhodanobacter的反硝化細菌在地下污染嚴重的地區(qū)占主導地位,Rhodanobacter是耐酸的反硝化劑[13]．S16樣本中的特有菌屬是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),氨氧化細菌在硝化過程中起重要作用,Nitrosospira主導土壤中的氨氧化群落[14]．S22樣本的優(yōu)勢菌種是白色念珠菌(Candidaalbicans),Candidaalbicans是一株致病菌,它可以進入血液引起全身性疾病,幾乎可以感染宿主的所有組織[15]．S22樣本中的特有菌種是Rickettsiabellii,Rickettsiabellii是一種專性細胞內(nèi)細菌,是少數(shù)編碼與細胞接合轉(zhuǎn)移遺傳元件相關的基因的立克次氏體之一[16-17]．

MetaPhlAn2可以基于宏基因組數(shù)據(jù),精確到微生物群體中種的構(gòu)成,包括細菌、古菌、真核生物和病毒．若數(shù)據(jù)庫中有株水平的基因組,也可以獲得更加深入的研究．MetaPhlAn2整理了超過17 000個參考基因組,包括13 500個細菌和古菌,3 500個病毒和110個真核生物．MetaPhlAn2可以準確估計物種的相對豐度并鑒定到種,本研究中的部分微生物序列只鑒定到屬,未精確到種,可能的原因是數(shù)據(jù)庫中沒有該微生物種水平的基因組數(shù)據(jù),可以推測該微生物具有新種的可能性,側(cè)面說明南極土壤中新種存在率高,具有較高的開發(fā)價值．研究表明,由于MetaPhlAn2具有更完善的病毒、真核生物和原核生物數(shù)據(jù)庫,MetaPhlAn2比MetaPhlAn、mOTU[18]、Kraken[19]得到的分析結(jié)果更準確．

南極地區(qū)土壤樣本由于位置特殊,運輸至國內(nèi)必須經(jīng)過低溫冷藏,很難實現(xiàn)對新鮮樣本進行微生物群落分析．本實驗通過宏基因組高通量測序技術對冷凍后的土壤樣本中的微生物群落構(gòu)成信息進行鑒定,為南極土壤微生物資源開發(fā)提供了信息儲備和技術支持．

當前對微生物互作的代謝調(diào)控通路分析和構(gòu)建多數(shù)是基于單一種群,但自然界中微生物群落是以復雜多樣的整體形式存在的．因此將微生物種群進行整體代謝調(diào)控網(wǎng)絡和通路的分析研究甚至加以改造和利用將是一個新的發(fā)展方向．高速發(fā)展的宏基因組高通量測序技術和分析手段為有效探索微生物群落的種群構(gòu)成和互相作用的調(diào)控網(wǎng)絡提供了強大的技術支持．